堿性蛋白酶酶解雞蛋清抗氧化肽的分離純化

王 瑞 雪, 孫 洋, 牟 光 慶, 姜 淑 娟, 錢 方

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034; 2.大連工業(yè)大學(xué) 信息科學(xué)與工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

根據(jù)自由基化學(xué)和自由基生物學(xué)理論,人體內(nèi)的自由基在正常情況下不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生損傷,機(jī)體隨著年齡的增長(zhǎng),自由基產(chǎn)生過(guò)多或清除過(guò)慢就會(huì)造成氧化應(yīng)激,使體內(nèi)的各種物質(zhì)如脂質(zhì)、糖類、蛋白質(zhì)、DNA等發(fā)生氧化反應(yīng),引起變性、交聯(lián)、斷裂等氧化傷害,從而引發(fā)各種疾病[1-2]?？寡趸木哂星宄杂苫种浦|(zhì)氧化的功能。隨著對(duì)蛋白酶解技術(shù)的深入研究,蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)生的抗氧化肽,具有極強(qiáng)的生物活性和多樣性,安全性高。近幾年從各種動(dòng)植物組織酶解液中提取抗氧化肽已成為研究熱點(diǎn)。2008年楊萬(wàn)根等[2]研究蛋清蛋白酶解物的抗氧化性,并分析了酶解物的氨基酸組成和相對(duì)分子量,但沒(méi)有對(duì)酶解液做進(jìn)一步的分離純化；2009年周國(guó)儀等[3]用Sephadex G-25、G-15凝膠柱對(duì)雞卵清蛋白多肽進(jìn)行純化,并研究其抗氧化性,但并未分析提純物質(zhì)的純度。

本研究采用超濾、DEAE-52離子層析和Sephadex G-25凝膠層析3種不同的分離方法對(duì)堿性蛋白酶的蛋清酶解液進(jìn)行分離純化,利用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定抗氧化性,薄層層析法分析多肽純度,彌補(bǔ)了前人研究的不足,旨在分離提取到活性強(qiáng)的多肽片段,為蛋清抗氧化肽的分離純化及其應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原 料

蛋清粉,大連韓偉食品有限公司；堿性蛋白酶(酶活力14.47 U/g),諾維信公司；Sephadex G-25,GE公司；Cellulose DE-52,GE公司；Millipore L-8200超濾杯,上海摩速科學(xué)器材有限公司；NaCl、正丁醇、冰醋酸、水合茚三酮,均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋清酶解液制備工藝

蛋清粉和堿性蛋白酶分別溶于磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L,pH 8.0)中。蛋清液85 ℃,變性30 min,冷至50 ℃,加入酶液(10 000 U/g蛋白),使蛋清液終質(zhì)量濃度為10 mg/mL。50 ℃反應(yīng)5 h,沸水滅酶10 min,4 000 r/min離心15 min,上清液即為蛋清酶解液,用HEW(Hydrolysates from Egg White)表示[4]。

1.2.2 抗氧化性測(cè)定

用鄰苯三酚自氧化法[5]測(cè)定樣品超氧陰離子的清除能力,表示樣品的抗氧化性。抗氧化肽的抗氧化性強(qiáng)弱與其濃度有關(guān),在測(cè)定不同樣品抗氧化性時(shí)要統(tǒng)一濃度,再比較其抗氧化性強(qiáng)弱。

按表1加入緩沖液和水,25 ℃恒溫20 min后加入25 ℃預(yù)熱過(guò)的鄰苯三酚 (對(duì)照管用10 mmol/L 鹽酸代替,調(diào)零),迅速搖勻,立即傾入比色杯中,在波長(zhǎng)420 nm處每0.5 min測(cè)定1次吸光度值A(chǔ)0,共測(cè)4 min。計(jì)算溶液吸光度值隨時(shí)間的變化率ΔA0。

表1 鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定

Tab.1 Protocol of velocity determination of pyorgallol autoxidation

試劑加樣量/mL對(duì)照管樣品管0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.20,內(nèi)含2 mmol/L EDTA)2.252.25H2O2.102.1010 mmol/L HCl0.15鄰苯三酚0.15

樣品測(cè)定:加入0.5 mL樣品液,相應(yīng)減少同體積水,測(cè)定加樣后自氧化速率ΔA1。計(jì)算清除超氧陰離子能力,平行3次。

清除率=(ΔA0-ΔA1)/ΔA0×100%

1.2.3 超 濾

用3 ku超濾膜分離蛋清酶解液,在0.3 MPa下將蛋清酶解液分離成截留液HEW-1(>3 ku)和透過(guò)液HEW-2(<3 ku),測(cè)定兩部分抗氧化性,濃縮備用[6]。

1.2.4 DEAE-52離子柱層析

超濾分離出強(qiáng)抗氧化活性的部分經(jīng)DEAE-52離子柱層析(2.0 cm×20 cm),洗脫液依次為0、0.02、0.05、0.10、0.20 mol/L NaCl水溶液,進(jìn)行梯度洗脫。上樣質(zhì)量濃度為10 mg/mL,上樣體積為5 mL,洗脫體積流量為80 mL/h,部分收集器每管收集4 mL,檢測(cè)收集液280 nm處的吸光度和抗氧化性,從而判斷抗氧化肽分離效果,根據(jù)層析圖譜將各組分合并濃縮,備用。

1.2.5 Sepadex G-25凝膠柱層析

DEAE-52離子柱分離得到的具有較強(qiáng)抗氧化性組分經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱(1.4 cm×45 cm) 進(jìn)一步分離,洗脫液為純水,上樣質(zhì)量濃度為5 mg/mL、體積為1 mL,洗脫體積流量為40 mL/h,部分收集器每管收集1 mL,檢測(cè)收集液280 nm處的吸光度和抗氧化性來(lái)判斷抗氧化肽分離效果,根據(jù)層析圖譜將各組分合并濃縮,備用。

1.2.6 薄層層析[7]

用硅膠板作薄層層析板,正丁醇-冰醋酸-水(體積比3∶1∶1)作展開(kāi)劑,其中加入0.4%茚三酮,85 ℃顯色15 min。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

由Origin 7.5軟件處理數(shù)據(jù),分析標(biāo)準(zhǔn)偏差并繪圖。用SPSS 12.0軟件分析樣品超氧陰離子清除率,得到樣品超氧陰離子的半抑制濃度,用IC50(mg/mL)表示[8]。

2 結(jié)果與討論

2.1 超濾法分離蛋清酶解液

用3 ku超濾膜將HEW分成HEW-1和HEW-2兩部分,在5 mg/mL相同質(zhì)量濃度下,HEW、HEW-1和HEW-2的超氧陰離子清除率分別為12.75%、8.41%、15.94%。由此可見(jiàn),HEW-2比HEW具有更強(qiáng)的超氧陰離子清除能力,文獻(xiàn)[9]表明,小于3 ku多肽的抗氧化性更為理想。超濾分離出具較強(qiáng)抗氧化性組分HEW-2,經(jīng)過(guò)真空濃縮,再經(jīng)DEAE-52離子柱層析分離。

2.2 DEAE-52離子柱分離組分HEW-2

由圖1可知,HEW-2經(jīng)DEAE-52離子柱層析分離,不同鹽濃度洗脫液梯度洗脫得到5個(gè)蛋白峰,分別為HEW-2-1純水洗脫峰、HEW-2-20.02 mol/mL NaCl洗脫峰、HEW-2-3 0.05 mol/mL NaCl洗脫峰、HEW-2-4 0.10 mol/mL NaCl洗脫峰、HEW-2-5 0.20 mol/mL NaCl洗脫峰。

圖1 DEAE-52離子柱分離HEW-2洗脫圖譜

Fig.1 Ion-exchange chromatogram of HEW-2 of on DEAE-52 column

各分離組分超氧陰離子的清除率如圖2所示,在0.5 mg/mL時(shí),HEW-2-1無(wú)清除活性,HEW-2-2清除率為2.08%,HEW-2-3清除率為1.19%,HEW-2-4清除率為0.30%,HEW-2-5清除率為0.60%。因此,組分HEW-2-2超氧陰離子清除能力最強(qiáng)。重復(fù)上樣,合并每次收集液,真空濃縮,再經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱分離。

2.3 Sephadex G-25凝膠柱層析分離組分HEW-2-2

由圖3可知,HEW-2-2經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱層析分離出3個(gè)組分。各分離組分超氧陰離子的清除率如圖4所示,在0.5 mg/mL相同質(zhì)量濃度下,蛋白組分HEW-2-2-1 的清除率為0.59%,HEW-2-2-2的清除率為1.20%,HEW-2-2-3清除率最高(2.41%),是組分HEW-2-2-1的4.1倍。從峰面積上看,HEW-2-2-3含量也最多?？梢?jiàn),經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱分離能得到活性較強(qiáng)的蛋清抗氧化肽HEW-2-2-3。根據(jù)凝膠柱分離原理,先出現(xiàn)的蛋白峰要比后出現(xiàn)的蛋白峰的分子質(zhì)量大,因此從本研究來(lái)看,針對(duì)小于3 ku 的多肽,肽鏈越短其抗氧化活性越強(qiáng)。

圖2 DEAE-52分離各組分的超氧陰離子清除能力

Fig.2 Superoxide anion radical scavenging activities fractions separated by DEAE-52 column

圖3 Sephadex G-25凝膠柱分離HEW-2-2洗脫圖譜

Fig.3 Gel filtration chromatogram of HEW-2-2 on Sephadex G-25 column

圖4 Sephadex G-25分離各組分的超氧陰離子清除能力

Fig.4 Superoxide anion radical scavenging activities of fractions separated by Sephadex G-25 column

2.4 雞蛋清抗氧化肽純度鑒定

由圖5可看出,未經(jīng)純化的雞蛋清酶解液是各種肽和氨基酸的混合物,各組分遷移率不同,故經(jīng)染色劑染色后連成一片(圖5中的1)；經(jīng)超濾分離后,從薄層層析結(jié)果(圖5中的2)可以看出減少了很多條帶,說(shuō)明已經(jīng)除去大量雜蛋白；經(jīng)DEAE-52纖維素離子柱層析分離得到的強(qiáng)抗氧化組分HEW-2-2在薄層層析染色后呈現(xiàn)3個(gè)點(diǎn)(圖5中的3),初步確定其由3個(gè)組分組成；最后經(jīng)Sephadex G-25層析分離出蛋清抗氧化肽,在薄層層析中呈現(xiàn)單一點(diǎn)(圖5中的4),說(shuō)明蛋清抗氧化肽已基本上得到了純化。

1,未經(jīng)純化的蛋清抗氧化肽；2,經(jīng)3 ku超濾膜分離后的蛋清抗氧化肽；3,經(jīng)DEAE-52纖維素純化后的蛋清抗氧化肽；4,經(jīng)Sephadex G-25純化后的蛋清抗氧化肽

圖5 蛋清抗氧化肽分離純化薄層層析圖

Fig.5 The TLC figure of isolation and purification of antioxidant from egg white

如表2所示,雞蛋清酶解液經(jīng)過(guò)逐步分離純化,超氧陰離子IC50由33.41 mg/mL降低到5.63 mg/mL,最終純化倍數(shù)達(dá)到5.63,分離得到薄層純的蛋清抗氧化肽HEW-2-2-3,其超氧陰離子IC50為5.63 mg/mL,蛋白回收率為13.42%。

表2 雞蛋清抗氧化肽的分離純化

Tab.2 Isolation and purification of antioxidant peptides derived from egg white

純化步驟超氧陰離子IC50/(mg·mL-1)純化倍數(shù)蛋白回收率/%雞蛋清酶解液33.411.00100.0超濾18.031.8558.40DEAE-52離子柱層析13.322.5125.04Sephadex G-25凝膠柱層析5.635.9313.42

3 結(jié) 論

(1)HEW超氧陰離子IC50為33.41 mg/mL,經(jīng)3 ku超濾膜分離得到HEW-2,IC50降到18.03 mg/mL,純化了1.85倍,蛋白回收率為58.4%,由薄層層析看出,超濾除去了大量雜蛋白。由此說(shuō)明蛋清酶解液中分子質(zhì)量小于3 ku的多肽具有較高的抗氧化性,這與之前的報(bào)道也相符。

(2)HEW-2經(jīng)DEAE-52離子柱分離,得到5個(gè)組分,其中HEW-2-2的抗氧化性最強(qiáng),超氧陰離子IC50為13.32 mg/mL,純化倍數(shù)提高到2.51,薄層層析染色后,出現(xiàn)3個(gè)點(diǎn),說(shuō)明HEW-2-2主要由3個(gè)蛋白組成。

(3)HEW-2-2經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱分離得到3個(gè)蛋白組分,組分HEW-2-2-3超氧陰離子IC50為5.63 mg/mL,薄層層析顯色其為單一點(diǎn),說(shuō)明基本上得到純化,純化倍數(shù)達(dá)到5.93,蛋白回收率為13.42%。HEW-2-2-3是Sephadex G-25 凝膠柱分離最后出現(xiàn)的蛋白峰,分子質(zhì)量最小,由此推測(cè)較短肽鏈可能具有更強(qiáng)的抗氧化活性。

(4)此研究為蛋清抗氧化肽的分離純化及工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù),且應(yīng)在多肽的抗氧化性和蛋白回收率之間找到一個(gè)平衡點(diǎn),使工業(yè)生產(chǎn)時(shí)即降低工業(yè)生產(chǎn)成本,又提高產(chǎn)品的抗氧化效果,這一點(diǎn)還有待于進(jìn)一步研究。

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