張春玉,宋 凱，劉黎紅，邵佳甲，逯家富

（1.長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)分院，吉林長(zhǎng)春 130033；2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130024；3.長(zhǎng)春師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130032）

液體發(fā)酵樹(shù)舌提取凝集素的生理學(xué)功能檢測(cè)

張春玉1,2,宋 凱3，劉黎紅1，邵佳甲1，逯家富1

（1.長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)分院，吉林長(zhǎng)春 130033；2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130024；3.長(zhǎng)春師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130032）

本文對(duì)樹(shù)舌菌絲體的深層發(fā)酵工藝進(jìn)行了初步的研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，樹(shù)舌菌絲體在大豆培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天，產(chǎn)出的總蛋白、總糖含量較高。從發(fā)酵液中分離和純化出樹(shù)舌凝集素具有明顯的生物學(xué)活性。

樹(shù)舌；液體發(fā)酵；凝集素

20世紀(jì)60年代，人們就開(kāi)始從真菌中提取生物活性物質(zhì)，如多糖、多糖蛋白復(fù)合物、凝集素、核糖失活蛋白、多肽、嘌呤和三萜類等，并評(píng)價(jià)它們的抗腫瘤和抗病毒活性[1-2]。在這種需求下，真菌有效成分的獲取成為研究的熱點(diǎn)[3-5]。

傳統(tǒng)方法都是通過(guò)野外采集或是人工栽培種植真菌子實(shí)體等，缺點(diǎn)是生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、品質(zhì)不易控制。1947年，Humfeld發(fā)明了深層發(fā)酵技術(shù)，使真菌具有可工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)、產(chǎn)量高、周期短、易于控制、質(zhì)量穩(wěn)定、相對(duì)容易進(jìn)行提取分離等優(yōu)點(diǎn)[6]。本實(shí)驗(yàn)首先以樹(shù)舌菌絲體為材料，對(duì)其深層發(fā)酵工藝的最優(yōu)化條件進(jìn)行研究。并對(duì)發(fā)酵液的有效成分凝集素進(jìn)行提取分離，通過(guò)凝血實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其生理學(xué)功能。

1 材料

1.1 菌株

樹(shù)舌菌種購(gòu)自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物所。

1.2 培養(yǎng)基

YPG培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1（或麥芽糖15 g·L-1），MgSO40.5 g·L-1，KH2PO41 g·L-1。配制固體培養(yǎng)基時(shí)加瓊脂粉15 g·L-1。110℃高壓滅菌30min。

不同配比花生和大豆培養(yǎng)基的配制如下表，高壓滅菌30min。

表1 不同培養(yǎng)基的成分配比 g·L-1

2 方法

2.1 接種及培養(yǎng)

樹(shù)舌菌種活化培養(yǎng)一周后，切取約1cm2的菌絲體小塊接種到以上6種液體培養(yǎng)基中，26℃搖床中，150rpm振蕩培養(yǎng)，分別重復(fù)4組。

2.2 樹(shù)舌菌絲體總蛋白含量的測(cè)定

（1）分別取每種培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲體干樣100mg，液氮中迅速研磨成細(xì)粉。

（2）加入到1ml預(yù)冷的10mMpH 7.4的PBS溶液中，4℃冰箱中放置24 h。

（3）12000rpm離心20 min。

（4）去除上清，將沉淀物用1ml預(yù)冷PBS緩沖液重新懸浮、離心。（5）取3和4步驟一次。

（6）BCA試劑盒法測(cè)定每種菌絲體中總蛋白含量。

2.3 樹(shù)舌菌絲體總糖含量的測(cè)定

（1）分別取每種培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲體干樣100mg，液氮中迅速研磨成細(xì)粉。

（2）樣品懸浮于25ml的80%的乙醇溶液中，95℃回流提取4h。

（3）回流后的混合液12000rpm離心20min。

（4）25ml熱水重新溶解沉淀，95℃回流提取2 h。

（5）取混合液12000rpm離心15min，取上清液。

（6）苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量。

2.4 樹(shù)舌菌絲體總生物量的測(cè)定

取一定量的發(fā)酵液3000rpm離心10 min。蒸餾水洗滌沉淀后置于55℃烘干稱重。

2.5 樹(shù)舌菌絲體發(fā)酵液pH值的測(cè)定

每天測(cè)定發(fā)酵液的pH值。

2.6 凝集素粗提液的制備和活性檢測(cè)

稱取液體培養(yǎng)的樹(shù)舌菌絲體60g（鮮重），加入10mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)置冰箱浸泡24h，經(jīng)高速搗碎機(jī)勻漿后，4層紗布過(guò)濾，濾液在3500r/min條件下離心20min，收集上清液，即得粗提液。

2.7 血細(xì)胞凝集活性的實(shí)驗(yàn)

按照凝血活性測(cè)定法，在“V”型血凝板上，在“V”型血凝板中加入25μl的生理鹽水，取凝集素粗提液（濃度為1mg·ml-1）25μl作倍比稀釋，每孔加入2%的血球懸液。搖動(dòng)血凝板使溶液混勻，血凝板在室溫放置1.5～2h，顯微鏡下檢測(cè)觀察結(jié)果。

3 結(jié)果與討論

3.1 總蛋白和總糖含量比較

蛋白質(zhì)和多糖是大型真菌食用和藥用價(jià)值的重要成分[7]，本實(shí)驗(yàn)將樹(shù)舌菌絲體分別接種于不同成分配比的花生和大豆液體培養(yǎng)基中，對(duì)所得的菌絲體的總蛋白含量、總糖含量進(jìn)行了測(cè)定。圖1給出了樹(shù)舌在大豆液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，獲得總蛋白量都略高于或等于在花生培養(yǎng)基中的，且在加入20 g·L-1原料時(shí)培養(yǎng)狀態(tài)最好，總蛋白含量最高。

圖1 不同濃度配比的大豆和花生培養(yǎng)基培養(yǎng)樹(shù)舌中總蛋白含量比較

總糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸方法，并以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將各樣品測(cè)得的平均OD值分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求得總糖的含量。如圖1所示，糖含量的變化與蛋白量變化相一致，大豆培養(yǎng)基要優(yōu)于花生培養(yǎng)基，且在20 g·L-1原料時(shí)培養(yǎng)狀態(tài)最好。

圖2 不同濃度配比的大豆和花生培養(yǎng)基培養(yǎng)樹(shù)舌中總糖含量比較

3.2 樹(shù)舌菌絲體總生物量

參照前面的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，選取最優(yōu)的花生培養(yǎng)基（20 g·L-1）進(jìn)行總生物量的測(cè)定。樹(shù)舌菌絲體在26℃條件下，110轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)數(shù)在搖床上振蕩培養(yǎng)，其生長(zhǎng)曲線近似“S”型（圖3）。接種初期菌絲體生長(zhǎng)很快，從第二天就進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，直至第五天達(dá)到閾值。隨后生長(zhǎng)速度放緩，可能是經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)的最高峰后培養(yǎng)基里的一些菌絲體代謝物產(chǎn)生了抑制的效果。7天后可見(jiàn)呈球狀的菌絲體(圖4)。

圖3 樹(shù)舌菌絲體生長(zhǎng)曲線

圖4 深層發(fā)酵培養(yǎng)的樹(shù)舌菌絲體

3.3 樹(shù)舌靈芝菌發(fā)酵液中pH值的變化

樹(shù)舌菌絲體發(fā)酵液的pH值變化見(jiàn)圖5，pH值在最初的兩天有略下降的趨勢(shì)，到了第三天迅速降低。結(jié)合上面的生長(zhǎng)曲線分析，是由于在生長(zhǎng)旺盛的階段，菌絲體產(chǎn)生大量的酸性物質(zhì)，直至發(fā)酵的第六天，這時(shí)菌絲體生長(zhǎng)基本穩(wěn)定，pH值也穩(wěn)定在4.0～4.5之間。這說(shuō)明，隨著生長(zhǎng)狀態(tài)的變化，樹(shù)舌菌絲體為了使環(huán)境適應(yīng)自身的生長(zhǎng)代謝，對(duì)酸堿度進(jìn)行了自我調(diào)節(jié)。

圖5 樹(shù)舌菌絲體發(fā)酵液pH值的變化曲線

3.4 凝血實(shí)驗(yàn)

真菌凝集素的細(xì)胞凝集作用是凝集素分子的一個(gè)亞基與一個(gè)細(xì)胞表面的凝集素專一識(shí)別的糖基結(jié)合，另一個(gè)亞基與另一個(gè)細(xì)胞上的糖基結(jié)合，從而通過(guò)凝集素的“架橋”作用而導(dǎo)致的本試驗(yàn)中[8-9]，樹(shù)舌菌絲體粗提液經(jīng)血凝實(shí)驗(yàn)檢測(cè)有凝血活性，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6左側(cè)A為實(shí)驗(yàn)樣品，右側(cè)B為對(duì)照組（以0.9%NaCl作陰性對(duì)照）。這表明在這種發(fā)酵條件下，獲得的凝集素具有良好的生理學(xué)活性。

圖6 凝集素對(duì)血細(xì)胞的凝血反應(yīng)的顯微照片

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)樹(shù)舌菌絲體的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)工藝進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)設(shè)定不同氮源、氮源不同含量、不同的發(fā)酵時(shí)間，對(duì)其總蛋白含量、總糖含量進(jìn)行測(cè)定比較，確定了20 g·L-1的大豆培養(yǎng)基最為樹(shù)舌菌絲體大規(guī)模深層發(fā)酵生產(chǎn)更為優(yōu)良。在這種情況下，發(fā)酵的生物量變化和發(fā)酵液pH值變化相一致，且發(fā)酵5天時(shí)，樹(shù)舌菌絲體生長(zhǎng)狀態(tài)最為良好，此時(shí)提取凝集素具有明顯的凝血活性。

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Physiologic Function Tests on the Extraction of Lectin from Liquid Fermentation Ganoderma

ZHANGChun-yu1,2,SONGKai3,LIULi-hong1,SHAOJia-jia1,LUJia-fu1
(1.School ofFood Production Technologyand Biotechnology,Changchun Vocational Institute ofTechnology, Changchun 130033,China;2.School ofLife Sciences,Northeast Normal University,Changchun 130024,China; 3.School ofLife Sciences,Changchun Normal University,Changchun 130032,China)

This paper studies the deep fermentation process of the Ganoderma mycelium preliminarily.Test results showthat after 5 days of cultivation in soybean agar,the Ganoderma mycelium’s total protein and total sugar content is higher,and the lectin ofGanoderma isolated and purified fromfermentation liquid has obvious biological activity.

Ganoderma;liquid fermentation;lectin

O625

A

1008-178X(2012)09-0069-05

2012-06-15

吉林省教育廳項(xiàng)目（2010第480號(hào)）。

張春玉(1972-)，女，吉林長(zhǎng)春人，長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)分院副教授，博士，從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。