朱中元，張 丹，王海波，肖勁逐，邱一帆，顏 磊，陳 德，劉愛國(guó)，楊 欣

結(jié)核病是當(dāng)今世界上由單一致病菌感染引起的死亡率最高的疾病，嚴(yán)重威脅著人類的健康。全世界大約有三分之一的人感染了結(jié)核菌，并且感染人數(shù)在以每年700萬(wàn)～800萬(wàn)的速度增加。因此，結(jié)核病快速準(zhǔn)確的早期診斷成為控制結(jié)核病流行的重要手段之一。目前我國(guó)結(jié)核病診斷主要由臨床表現(xiàn)、影像學(xué)診斷結(jié)合痰涂片鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)或PPD皮試進(jìn)行。但是由于常規(guī)細(xì)菌學(xué)檢查方法的靈敏性差，而且細(xì)菌培養(yǎng)費(fèi)時(shí)長(zhǎng)（6～8周），以及受人為操作影響等原因，這些方法對(duì)于結(jié)核病快速的幫助有限［1］。ELISA方法測(cè)定結(jié)核菌抗體水平具有簡(jiǎn)單、低廉、快速的特點(diǎn)，作為結(jié)核病的輔助診斷方法之一，正逐漸被眾多研究者所重視。結(jié)核菌分泌許多蛋白到細(xì)胞外，在結(jié)核病人的免疫反應(yīng)發(fā)揮了很重要的作用。研究表明CFP－10是T細(xì)胞的靶抗原，能誘導(dǎo)皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)并刺激外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生特異性IFN－γ［2］。Rv2626c抗原是 MTB休眠期特異表達(dá)的蛋白之一，有較強(qiáng)的抗原性，可激發(fā)宿主機(jī)體產(chǎn)生較高的抗體水平［3］。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建結(jié)核菌CFP－10、Rv2626c蛋白表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，以獲得大量CFP－10抗原、Rv2626c抗原，同時(shí)將重組的CFP－10、Rv2626c蛋白組成聯(lián)合抗原進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，為探索重組蛋白在結(jié)核病血清學(xué)診斷的應(yīng)用奠定前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 菌種和載體 結(jié)核菌H37 Rv、大腸桿菌BL21（DE3）、表達(dá)載體p ET－30a均為海南省農(nóng)墾總醫(yī)院保存。

1．2 試劑 β－硫代半乳糖苷（IPTG）、硫酸卡那霉素（Kan）購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶和DNA Mar ker購(gòu)自寶生物（大連）有限公司。預(yù)染蛋白Mar ker購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自北京天根生物科技有限公 司。6×His－tagged Ni－NTA Agar ose蛋白純化柱是QIAGEN公司產(chǎn)品。常用高純度生化試劑均為Biosharp公司產(chǎn)品，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。HRP標(biāo)記抗人Ig購(gòu)自Solar bio公司。顯色底物購(gòu)自英科新創(chuàng)科技有限公司。

1．3 血清來(lái)源 118份肺結(jié)核患者血清由海口市結(jié)核病防治所提供，其中痰涂陽(yáng)性患者血清20份，痰涂陰性患者血清98份；96份健康查體者血清由海南省農(nóng)墾總醫(yī)院提供。

1．4 引物 根據(jù)Gen Bank中結(jié)核菌標(biāo)準(zhǔn)株H37 Rv的CFP－10、Rv2626c基因序列，設(shè)計(jì) CFP－10基 因5′端 引 物 為 Ⅰ：5′－CCGGAATTCATGGCAGAGATGAAGACCGAT－3′，3′端 引 物 為 Ⅱ：5′－CCCAAGCTTTCAGAAGCCCATTTGCGAGGAC－3′。Ⅰ、Ⅱ的酶切位點(diǎn)分別為Eco RⅠ和Hin dⅢ；Rv2626c基因5′端 引物 Ⅲ：5′－CCGGAATTCATGACCACCGCACGCGACA－3′，3′端引物Ⅳ：5′－CCGCTCGAGCTAGCTGGCGAGGGCCAT－3′。Ⅲ、Ⅳ酶切位點(diǎn)分別為Eco RⅠ和XhoⅠ。引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1．5 CFP－10、Rv2626c基因的擴(kuò)增與克隆 以H37 Rv基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增CFP－10、Rv2626c基因片段。反應(yīng)條件：95℃，5 min；95℃，30 s，53 ℃，30 s，72 ℃，1 min，36個(gè)循環(huán)；72 ℃，7 min；4℃，保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒處理后，經(jīng)雙酶切，酶切后擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收與同樣方式處理的表達(dá)質(zhì)粒p ET30a在T4 DNA連接酶作用下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性重組子送南京金斯瑞生物工程有限公司測(cè)序。

1．6 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將通過測(cè)序驗(yàn)證正確的重組子接種于含50 mg／L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，待37℃振蕩培養(yǎng)至吸光度（A600）值為0．6～0．8，加入IPTG至終濃度為1 mmol／L，繼續(xù)37℃振蕩培養(yǎng)，從開始誘導(dǎo)表達(dá)1 h起每隔1 h留樣待檢，至誘導(dǎo)表達(dá)6 h時(shí)止，收集菌體，進(jìn)行SDSPAGE分析。

1．7 重組蛋白表達(dá)形式鑒定及純化 收集按最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件誘導(dǎo)的菌體，冰浴超聲破碎后離心，分別收集沉淀和上清，SDS－PAGE分析目的蛋白的表達(dá)形式；采用 QIAGEN 公司6×His－tagged Ni－NTA Agarose蛋白純化柱分離純化帶His標(biāo)簽的重組蛋白。

1．8 重組CFP－10、Rv2626c蛋白抗原ELISA檢測(cè)通過方陣法確定抗原的最適包被濃度和最適第二抗體稀釋倍數(shù)。用p H9．6包被緩沖液將重組CFP－10蛋白、Rv2626c蛋白以及2種蛋白的混合物，按2、1、0．5、0．1和0．01μg／孔進(jìn)行稀釋，每孔100μL加樣，4℃包被過夜；次日將孔內(nèi)剩余液體甩干，洗滌液洗3次；將小牛血清稀釋10倍，以每孔200μL加樣，37℃下封閉1 h；甩干，洗滌液洗3次；待測(cè)血清樣本用PBS進(jìn)行1∶50稀釋，取100μL加入反應(yīng)孔，37℃下放置1．5 h，將孔內(nèi)剩余液體甩干，洗滌液洗3次；將 HRP－二抗按1∶500，1∶1 000和1∶1 500進(jìn)行稀釋，以每孔100μL加樣，37℃下放置1 h；洗滌液洗3次，每孔加底物液A、B各50μL，避光反應(yīng)15 min；加入1 mol／L HCl終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀測(cè)定OD450值，結(jié)果判定以待測(cè)樣本的OD450值于陰性對(duì)照的OD450值之比≥2．1為陽(yáng)性，計(jì)算其敏感性與特異性。

2 結(jié) 果

2．1 重組CFP－10、Rv2626c質(zhì)粒的鑒定 從構(gòu)建陽(yáng)性重組菌中挑取重組克隆，搖菌后提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定（圖1）。兩者重組質(zhì)粒酶切片段和PCR擴(kuò)增片段相同，分別約為303 bp、432 bp。重組質(zhì)粒測(cè)序后，其構(gòu)建序列與Gen Bank中結(jié)核菌H37Rv的基因完全相同。

圖1 重組質(zhì)粒PET30a－CFP－10、PET30a－Rv2626c的酶切鑒定結(jié)果M：DNA marker；1：CFP－10 基 因 PCR 產(chǎn) 物．2－3：PET－30a－CFP－10雙酶切．4：Rv2626c基因 PCR產(chǎn)物，5－6：PET－30a－Rv2626c雙酶切片段。Fig．1 Endonuclease digestion results of expressing plasmid p ET30a－CFP－10 and p ET30a－Rv2626cM：DNA mar ker；1：PCR pr oduct of MTB CFP－10 gene；2－3：Products of Eco RⅠand Hin d Ⅲ digestion of p ET－30a－CFP－10；4：PCR product of MTB Rv2626c gene；5－6：Products of Eco RⅠand Xho I digestion of p ET－30a－Rv2626c

2．2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 將篩選到的工程p ET－30a－CFP－10／BL21（DE3）、p ET－30a－Rv2626c／BL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，取菌體沉淀進(jìn)行SDS－PAGE分析（圖2），可見明顯的特異表達(dá)產(chǎn)物條帶。重組CFP－10蛋白相對(duì)分子質(zhì)量比預(yù)計(jì)分子質(zhì)量大，可能是附加表達(dá)了載體上多余的序列；重組Rv2626c蛋白相對(duì)分子質(zhì)量與預(yù)計(jì)相符，而未誘導(dǎo)的菌體沒有明顯的條帶。

2．3 重組CFP－10、RV2626c蛋白的可溶性分析誘導(dǎo)后的菌體經(jīng)超聲波破碎，離心，分別取上清和沉淀進(jìn)行 SDS－PAGE。結(jié)果見圖3，重組 CFP－10、Rv2626c蛋白主要存在于上清部分，以可溶性蛋白形式存在。

2．4 重組CFP－10蛋白的純化 收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌體沉淀，經(jīng)超聲波破碎，離心，取上清通過鎳瓊脂糖凝膠純化柱分離純化。收集洗脫峰溶液進(jìn)行SDS－PAGE分析，結(jié)果見圖4。

圖2 重組工程菌表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE電泳圖M：預(yù)染蛋白質(zhì) Mar ker；1：未誘導(dǎo)的重組CFP－10菌株；2：誘導(dǎo)6 h后的重組CFP－10菌株；3：未誘導(dǎo)的重組Rv2626c菌株；4：誘導(dǎo)6h后的重組Rv2626c菌株。Fig．2 SDS－PAGE results of the p ET－30a－CFP－10／BL21（DE3）and p ET－30a－Rv2626c／BL21（DE3）M：Pre－stained protein MW marker；Lane 1：p ET－30a－CFP－10／BL21（DE3）without IPTG induction；Lane 2：p ET－30a－CFP－10／BL21（DE3）after 6 h of IPTG induction；Lane 3：p ET－30a－Rv2626c／BL21（DE3）wit hout IPTG induction；Lane 4：p ET－30a－Rv2626c／BL21（DE3）after 6 h of IPTG induction．

圖3 重組CFP－10、Rv2626c肽段表達(dá)方式分析M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：重組CFP－10蛋白菌體超聲波破碎后的上清；2：重組CFP－10蛋白菌體超聲波破碎后的沉淀；3：重組Rv2626c蛋白菌體超聲波破碎后的上清；4：重組Rv2626c蛋白菌體超聲波破碎后的沉淀。Fig．3 Peptide expression analysis of recombinant CFP－10 and Rv2626cM：pre－stained protein MW mar ker；1：Super natant of CFP－10 expressing E．coli；2：Sedi ments of CFP－10 expressing E．coli；3：Super natant of Rv2626c expressing E．coli；4：Sedi ments of Rv2626c expressing E coli．

圖4 純化重組CFP－10蛋白、重組Rv2626c蛋白SDS－PAGE電泳圖M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：重組CFP－10蛋白菌株誘導(dǎo)產(chǎn)物；2：純化重組CFP－10蛋白；3重組Rv2626c蛋白菌株誘導(dǎo)產(chǎn)物；4：純化重組Rv2626c蛋白。Fig．4 SDS－PAGE electrophoresis figure on r CFP－10 and r Rv2626 proteins before and after purificationM：Pre－stained protein MW mar ker；1：Super natant of CFP－10 expressing E．coli；2：Purified r CFP－10；3：Super natant of Rv2626c expressing E．coli；4：Purified r RV2626c．

2．5 ELISA分析 通過方陣法確定CFP－10肽段最適包被濃度為0．1μg／孔，Rv2626c蛋白抗原為0．1μg／孔，混合抗原最適工作濃度為0．1μg／孔，二者比例為1∶1。酶標(biāo)二抗最適工作濃度為1∶1 500。然后在該條件下，用重組 CFP－10 蛋白、Rv2626c蛋白及二者組成的聯(lián)合抗原對(duì)118份確診病人血清和96份健康人血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示重組CFP－10蛋白抗原檢測(cè)結(jié)核特異性抗體的總敏感性為75．4%（痰涂陽(yáng)70．0%／痰涂陰76．5%），檢測(cè)健康查體者對(duì)照血清特異性為85．4%（82／96）；重組Rv2626c蛋白抗原檢測(cè)結(jié)核特異性抗體的敏感性為44．1%（痰涂陽(yáng)45．0%／痰涂陰43．9%），檢測(cè)健康查體者對(duì)照血清特異性75．0%（72／96）；聯(lián)合抗原檢測(cè)結(jié)核特異性抗體的總敏感性為77．1%（痰涂陽(yáng)80．0%／痰涂陰76．5%），檢測(cè)健康查體者對(duì)照血清特異性為82．3%（79／96）。

3 討 論

CFP－10是1998年被鑒定出來(lái)的低分子量蛋白，又名mtbll，是一種短期培養(yǎng)濾液蛋白，由l hp基因編碼，屬于ESAT－6家族［4］。CFP－10基因大小為303 bp，編碼100個(gè)氨基酸，分子量為10 k Da。只存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及其它幾種致病性分枝桿菌中，BCG及其它分枝桿菌不表達(dá) CFP－10［5］。因此CFP－10作為抗原可以將結(jié)核病與BCG免疫以及非結(jié)核菌感染區(qū)別開來(lái)。Renshaw等研究表明，CFP－10表現(xiàn)出與ESAT－6相當(dāng)?shù)腡細(xì)胞性免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)的IFN－γ的釋放水平與ESAT－6相當(dāng)，具有潛在的診斷應(yīng)用價(jià)值。

Rv2626c抗原是MTB休眠期特異表達(dá)的蛋白之一，其功能尚不清楚。Rv2626c基因長(zhǎng)432 bp，編碼143個(gè)氨基酸，受控于休眠調(diào)節(jié)子Dos R（dormancy regulon），該基因的表達(dá)是MTB進(jìn)入休眠期的重要標(biāo)志之一。研究發(fā)現(xiàn)Rv2626c基因及其多個(gè)下游基因的表達(dá)，可使MTB進(jìn)入休眠狀態(tài)，抵御宿主免疫系統(tǒng)的殺傷。Rv2626c抗原可激發(fā)宿主機(jī)體產(chǎn)生較高的抗體水平，因此，Rv2626c抗原可作為鑒別MTB在宿主機(jī)體中的感染狀態(tài)的血清學(xué)診斷候選抗原。

本實(shí)驗(yàn)采用基因工程的手段來(lái)獲得目的基因，構(gòu)建了CFP－10、Rv2626c蛋白的原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中成功表達(dá)了重組蛋白，通過對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的純化，獲得了大量CFP－10、Rv2626c抗原，這為探究重組肽段在結(jié)核病血清學(xué)診斷的應(yīng)用奠定了前期抗原基礎(chǔ)。

通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）分別檢測(cè)重組CFP－10、Rv2626c蛋白與兩者組成的聯(lián)合抗原的Ig G抗體，結(jié)果顯示聯(lián)合抗原檢測(cè)結(jié)核特異性抗體的敏感性為77．1%，檢測(cè)健康對(duì)照血清特異性為82．3%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，二者聯(lián)合檢測(cè)的敏感性和特異性較高。應(yīng)進(jìn)一步純化這兩種蛋白，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，提高檢測(cè)的穩(wěn)定性。

［1］Karin W，Rosenkrands I，Okkels L M，etal．Assessing the serodiagnostic potential of 35 Mycobacteriu m tuberculosis proteins and identification of f our novel serological antigens［J］．J Clin Micr obiol，2005，43（1）：57－65．DOI：10．1128／JCM．43．1．57－65．2005

［2］Dillon DC，Alderson MR，Day CH，etal．Molecular and i mmunological characterization of Mycobacteriu m tuberculosis CFP－10，an i mmunodiagnostic antigen missing in Mycobacterium bovis BCG［J］．J Clin Microbiol，2000，38（9）：3285－3290．DOI：10．1128／JCM．38．9．3285－3290．2000

［3］Rosenkrands I，Slayden RA，Crawford J，etal．Hypoxic response of Mycobacteriu m tuberculosis studied by metabolic labeling and proteo me analysis of cellular and extracell ular proteins［J］．J Bacteriol，2002，184（13）：3485－3491．DOI：10．1128／JB．184．13．3485－3491．2002

［4］Berthet FX，Ras mussen PB，Rosenkrands I，etal．A Mycobacterium tuberculosis operon encoding ESAT－6 and a novel low－molecular－mass culture filtrate protein （CFP－10）［J］．Micr obiology，1998，144 （11）：3195－3203．DOI：10．1099／00221287－144－11－3195

［5］Lewis KN，Liao R，Guinn K M，etal．Deletion of RD1 from Mycobacteriu m tuberculosis mi mics bacilli Cal mette Guerin attenuation［J］．J Infect Dis，2003，187（1）：117－123．DOI：10．1086／345862