張海玉,單玉興,高 輝,丁福鵬,王 井*
(1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部第一醫(yī)院 小兒外科,吉林 長(zhǎng)春130021;2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部第一醫(yī)院二部 骨科,吉林 長(zhǎng)春130021)
骨肉瘤(成骨肉瘤)是最常見(jiàn)的惡性骨腫瘤。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì),發(fā)病率很高,占原發(fā)惡性骨腫瘤的22.36%。典型骨肉瘤一般見(jiàn)于10-20歲年齡段,但在任何年齡段都可發(fā)生,包括嬰幼兒,兒童以及老年人。男性發(fā)病率較高,男女之比約2∶1。具有很強(qiáng)的局部浸潤(rùn)能力和肺轉(zhuǎn)移能力。雖然手術(shù)和化療的應(yīng)用使骨肉瘤的預(yù)后有很大的提高,但是很多患者因耐藥而預(yù)后不好。端粒酶在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生,發(fā)展中所起的作用已被人們廣泛的認(rèn)可。大量的研究表明,90%以上的腫瘤細(xì)胞都具有較高的端粒酶活性,而多數(shù)的體細(xì)胞則缺少端粒酶活性。這便給了人們攻克腫瘤的希望,放射生物學(xué)研究表明,電離輻射作用后可改變細(xì)胞周期的進(jìn)程[1,2],但是射線照射后骨肉瘤細(xì)胞中的端粒酶活性報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究不同劑量的X射線輻射對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中端粒酶活性的影響,為放射治療骨肉瘤的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
1.1 細(xì)胞培養(yǎng)
人骨肉瘤HOS細(xì)胞系,購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。培養(yǎng)基為含10%滅活小牛血清的高糖含酚紅DMEM(GIBCO公司),內(nèi)含100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素。將每孔以1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中,在37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d,以備照射。
1.2 X射線
X射線能量為6MeV/u,靶皮距100cm,劑量率2Gy/min,設(shè)定細(xì)胞吸收劑量為0Gy(對(duì)照細(xì)胞)、1、2、4和8Gy。每個(gè)劑量點(diǎn)設(shè)3個(gè)平行樣,全部過(guò)程在室溫下進(jìn)行。細(xì)胞照射后,立即更換培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)72h。
1.3 輻射敏感性測(cè)定
采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活。繼續(xù)培養(yǎng)72h后每孔加入 MTT溶液(5mg/ml)20μl,培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h,終止培養(yǎng),棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150μl DMSO,振蕩10min。選擇570nm波長(zhǎng),在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值,記錄結(jié)果。以時(shí)間為橫軸,光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(survival fraction,SF)計(jì)算公式為:sF(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。最后以3個(gè)平行樣品的sF均值±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)繪制劑量-存活曲線。
1.4 指標(biāo)檢測(cè)
1.4.1 端粒酶活性測(cè)定 用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)端粒酶活性。Elisa試劑盒來(lái)源于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。將被檢樣品以1∶50,1∶100,1∶200,1∶400建立濃度梯度,將稀釋好的樣品加入酶標(biāo)反應(yīng)孔中,每樣品加3孔,每孔100μl,依據(jù)Elisa試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行操作,檢測(cè)端粒酶活性。
1.4.2 端粒酶逆轉(zhuǎn)率酶(hTERT)測(cè)定 應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)hTERT的表達(dá)情況。SP試劑盒來(lái)源于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。用4%的多聚甲醛磷酸緩沖液固定細(xì)胞爬片10-20min,干燥后PBS沖洗3次。然后具體操作依照試劑盒說(shuō)明。應(yīng)用image pro plus軟件對(duì)免疫組化圖像進(jìn)行半定量分析。
1.4.3 端粒酶RNA測(cè)定 RT-PCR檢測(cè)端粒酶基因的表達(dá):按Trizol Reagent RNA提取試劑提取總RNA。測(cè)定端粒酶RNA的兩條引物序列分別為:5′-ACCACCAGCGTGTCTGGAGCAAGCCCA AC-3′和 5′-GGGCAACGAAGCGGAGTCGCTGGCACTG-3′,RT-PCR的 產(chǎn) 物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。葡萄糖-3-磷酸脫氫酶作為內(nèi)對(duì)照。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以ˉx±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。
3.1 X線照射后細(xì)胞存活
細(xì)胞存活曲線描述了輻射吸收劑量與細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)之間的關(guān)系。用MTT法測(cè)定,設(shè)3個(gè)平行樣,細(xì)胞存活曲線按對(duì)數(shù)標(biāo)度繪制。(見(jiàn)圖1)。骨肉瘤HOS細(xì)胞的存活明顯降低,而且未見(jiàn)明顯的后期細(xì)胞增殖。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,細(xì)胞的存活率與輻照劑量呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)。
圖1 不同劑量X線照射后72h細(xì)胞存活曲線
3.2 X線照射后端粒酶活性
細(xì)胞受照后72h進(jìn)行端粒酶提取和 酶聯(lián)免疫法端粒酶活性檢測(cè)(見(jiàn)圖2)。由圖可知其端粒酶活性隨輻照劑量增加而增高。其中,輻射劑量在1 Gy、2Gy處,其端粒酶活性較對(duì)照組升高相對(duì)較??;輻射劑量在4Gy處,端粒酶活性最強(qiáng),實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組,且增長(zhǎng)勢(shì)頭強(qiáng)勁;而輻射劑量在8Gy處,端粒酶活性仍高于對(duì)照組,但是增長(zhǎng)勢(shì)頭明顯回落,可能與細(xì)胞存活率明顯下降有關(guān),可能與細(xì)胞增殖受到明顯抑制有關(guān)。
圖2 不同劑量X線照射后72h細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性比較
3.3 X線照射后hTERT檢測(cè)
應(yīng)用Image P ro Plus 5.0軟件對(duì)免疫組化圖像分析表明各圖像灰度值逐漸降低,亦說(shuō)明各圖像蛋白含量逐漸增高。表格數(shù)據(jù)顯示實(shí)驗(yàn)組的hTERT表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組,且表達(dá)強(qiáng)度明顯與劑量呈正相關(guān)(見(jiàn)表1)。
表1 免疫組化圖像灰度值分析
3.4 X線照射后端粒酶RNA的表達(dá)
抽取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的端粒酶RNA,應(yīng)用RTPCR技術(shù)。(見(jiàn)圖3)照射后,骨肉瘤HOS細(xì)胞內(nèi)端粒酶RNA高表達(dá),在4Gy時(shí),電泳條帶亮度最高,說(shuō)明樣品含量最大??傮w來(lái)看,很明顯樣品含量與劑量呈正相關(guān)。
圖3 不同劑量X線照射后72h端粒酶RNA水平
放射治療是治療惡性腫瘤的主要手段之一,尤以X線最為普遍應(yīng)用。經(jīng)放射治療后,正常細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞獲得同樣的殺傷效果,但是由于惡性腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足和增殖機(jī)制不完善,與正常組織相比,它的組織修復(fù)能力相對(duì)較差。這是放射治療的基本原理。
端粒酶是腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖的基礎(chǔ),除了少數(shù)的造血干細(xì)胞,生殖細(xì)胞,T細(xì)胞,B細(xì)胞及皮膚基底層細(xì)胞等增殖細(xì)胞外,正常細(xì)胞內(nèi)無(wú)端粒酶。hTERT是端粒酶的蛋白質(zhì)亞單位,與端粒酶的活性高低密切相關(guān),是端粒酶延長(zhǎng)端粒的關(guān)鍵酶。人類的端粒酶有3個(gè)亞基,包括人端粒酶RNA、端粒酶相關(guān)蛋白和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT),前兩種成分在端粒酶陰性的正常組織中廣泛表達(dá),而hTERT僅在端粒酶陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。腫瘤細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有hTERT,端粒酶無(wú)法維持端粒的長(zhǎng)度。眾多研究表明,端粒酶活性降低的關(guān)鍵是hTERT活性的下調(diào);端粒酶激活的主要途徑也是hTERT的表達(dá)的增強(qiáng)。
細(xì)胞內(nèi)的DNA是放射線的靶點(diǎn)。X線進(jìn)入人體后,產(chǎn)生的次級(jí)電子可直接擊中細(xì)胞內(nèi)的DNA雙鏈,使其產(chǎn)生單鏈或雙鏈斷裂。水分子受到射線作用后發(fā)生電離而產(chǎn)生自由基,自由基和有毒成分對(duì)DNA分子產(chǎn)生破壞作用,達(dá)到殺死細(xì)胞的作用。
本實(shí)驗(yàn)表明,隨著X線劑量的增加,端粒酶活性,hTERT及端粒酶RNA的表達(dá)均增高且大致同步。其中,在1Gy、2Gy處,端粒酶活性,hTERT和端粒酶RNA表達(dá)較對(duì)照組升高相對(duì)較小,但細(xì)胞存活率較高,這可能是射線量低,沒(méi)能達(dá)到致死腫瘤細(xì)胞的程度;當(dāng)輻射劑量達(dá)4Gy、8Gy時(shí),端粒酶活性,hTERT和端粒酶RNA表達(dá)較對(duì)照組升高非常明顯,細(xì)胞存活率急劇下降,可能是射線量達(dá)到了致死腫瘤細(xì)胞的程度,腫瘤細(xì)胞需要調(diào)動(dòng)所有機(jī)制阻止細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序,hTERT和端粒酶RNA表達(dá)增強(qiáng),端粒酶異?;钴S。也可能是射線損傷了端粒,使端粒酶活性增強(qiáng),但端粒酶活性的增強(qiáng)最終也沒(méi)能夠阻止骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序。雖然在8Gy時(shí),端粒酶活性,hTERT及端粒酶RNA含量比4Gy時(shí)的增長(zhǎng)勢(shì)頭有所降低,但仍強(qiáng)于對(duì)照組。說(shuō)明在8Gy是,單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的端粒酶,hTERT和端粒酶RNA含量的比例較其他樣品均高。這些數(shù)據(jù)表明,在x射線的干擾下:X射線劑量與骨肉瘤細(xì)胞存活率呈負(fù)相關(guān);X射線劑量與端粒酶活性呈正相關(guān);骨肉瘤細(xì)胞存活率與端粒酶活性呈負(fù)相關(guān);hTERT,端粒酶RNA和端粒酶活性三者屬同步關(guān)系。
也有實(shí)驗(yàn)表明端粒酶活性水平并不與照射后細(xì)胞的存活水平平行,但是端粒酶活性變化與輻照所用的射線及輻照劑量有關(guān)已成共識(shí)。中小劑量照射后細(xì)胞死亡數(shù)隨著照射劑量的增加而增加,而修復(fù)反應(yīng)明顯,常表現(xiàn)出酶活性的增高。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)能否真實(shí)地反映放療對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的殺傷性,是否能夠確定放療對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的療效,還不能確定;端粒酶是否參與放射誘發(fā)的損傷修復(fù)及端粒酶活性檢測(cè),能否用于放療效果評(píng)估有待深入研究;端粒酶與放射治療的關(guān)系還有待進(jìn)一步探討。
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