郭 陽，熊和平，陳 平，王延周，陳繼康，譚龍濤，鄭建樹，喻春明

（中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所，湖南 長沙 410205）

苧麻屬于蕁麻科（Urticaceae）苧麻屬（Boehmeria）宿根性草本植物，是一種多年生韌皮纖維植物。我國苧麻栽培歷史悠久，距今已有4 000余年。長江中下游地區(qū)的湖南、四川、江西、湖北等省是我國苧麻的主產(chǎn)區(qū)。由于各主產(chǎn)區(qū)的生態(tài)環(huán)境不同，通過長期的自然選擇和生產(chǎn)實踐，形成了種類繁多的地方品種，為苧麻育種奠定了基礎(chǔ)。許多學者根據(jù)經(jīng)濟性狀和形態(tài)學特征等對苧麻品種資源進行了分類整理[1]。但傳統(tǒng)的利用系譜分析、地理來源及有限的表型鑒定數(shù)據(jù)，難以將大量的品種資源區(qū)別開來。

SSR分子標記具有檢測手段簡便易行，結(jié)果穩(wěn)定可靠、重復性好，呈現(xiàn)共顯性遺傳，可以揭示完整遺傳信息等優(yōu)點，非常適合遺傳多樣性研究[2]，目前已應用于水稻[3]、玉米[4]、棉花[5]、小麥[6]、豌豆[7]、蘋果[8]等多種作物的遺傳多樣性研究中。在苧麻研究中應用分子標記技術(shù)，可以從DNA水平準確區(qū)分不同的苧麻品種，減少人工調(diào)查的誤差，提高選擇效率[9-11]。隨著苧麻育種工作的開展，各地選育了較多的苧麻品種，但這些新品種間的遺傳關(guān)系還不清楚。該研究選擇來自湖南、江西、四川、湖北的9個主要苧麻品種和參加全國區(qū)試的新品系，利用SSR分子標記技術(shù)，分析這些品種的遺傳變異水平和相互間的親緣關(guān)系，以期為苧麻育種親本的合理選配提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試品種9個，分別為中苧1號、中苧2號、華苧4號、贛苧3號、川苧8號、中飼苧1號、圓葉青、74-69、D96-12，由中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所苧麻遺傳育種課題組收集保存（表 1）。

1.1.2 試 劑 植物基因組DNA提取試劑盒、Taq酶、10×Taq reaction Buffer、2.5 mmol/L dNTP、50 bp DNA Marker購于天根生化科技有限公司；其他試劑均購于生工生物工程股份有限公司。試驗所用的76對SSR引物[12]由中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所多年生麻類種質(zhì)資源課題組提供，并從76對SSR引物中篩選出了29對條帶清晰、有多態(tài)性的SSR引物（表 2）。

表1 供試苧麻品種列表

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用植物基因組DNA提取試劑盒提取9份苧麻種質(zhì)的基因組DNA。1%瓊脂糖凝膠電泳，利用BACKMAN DU800紫外分光光度計檢測DNA的純度和濃度。

1.2.2 SSR擴增反應 反應體系：PCR采用20 μL反應體系，其中 5 ng/μL 模板 2 μL，2.5 U/μL Taq酶 0.4 μL，10×Taq reaction Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.6 μL，0.2 μmol/L 的正向和反向引物各 1 μL，補充 ddH2O 至 20 μL。

擴增程序：94℃預變性 5 min；94℃變性 35 s，50℃～60℃（依引物而定）退火 50 s，延伸 50 s，30個循環(huán)；72℃延伸 5 min，4℃保存。

采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和張軍等[13]的銀染方法檢測PCR擴增產(chǎn)物。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 在銀染后的電泳圖上僅統(tǒng)計有差異、易于識別的多態(tài)性條帶。清晰且可重復的條帶記為“1”，同一位置上無條帶的記為“0”，建立“0”和“1”組成的原始矩陣，按照 Excel 5.0/95工作簿格式保存。利用NTsys 2.10e軟件中的SimQual程序計算遺傳相似系數(shù)。采用Clu-SHAN程序和UPGMA（非加權(quán)平均法）生成品種間親緣關(guān)系的聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR多態(tài)性分析

選取檢測結(jié)果符合試驗要求的9個苧麻品種的基因組DNA，從76對SSR引物中篩選出29對條帶清晰、有多態(tài)性的SSR引物對9個苧麻品種進行PCR擴增，引物B53和C14的擴增結(jié)果見圖1。29對SSR引物在9個苧麻品種中共檢測到152個位點，其中多態(tài)性位點為127，占總擴增位點的83.55%，表明9個苧麻品種具有較高的SSR多態(tài)性。每對引物檢測到2～11個位點，平均為4.38個，片段大小介于100～600 bp。Popgene分析顯示Nei基因多樣性為 0.337 1，Shannon信息指數(shù)為0.507 1，表明所選的9個苧麻主要品種的基因多樣度較低，雖然來自不同省份，但多樣性不夠豐富。

表2 SSR引物序列

圖1 引物B53和C14的SSR擴增結(jié)果

2.2 苧麻種質(zhì)的聚類分析

根據(jù)9個供試苧麻品種間SSR標記揭示的遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA方法進行遺傳聚類分析，結(jié)果如圖2所示，9個苧麻種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)為0.58～0.78，在遺傳相似系數(shù)為0.62處將全部材料分為A、B、C三類。A類包括中苧1號、中苧2號、川苧8號、贛苧3號、74-69、圓葉青、D96-12，這7個品種含有共同的原始親本黃殼早。中苧2號與川苧8號還具有相同的原始親本黑皮蔸，二者遺傳相似系數(shù)達到0.70。中苧1號和D96-12都是以圓葉青為母本選育出來的優(yōu)良品種，二者遺傳相似系數(shù)最高，高達0.77。中飼苧1號和華苧4號各單獨歸為1類。

圖2 基于SSR標記的9個苧麻品種的聚類圖

3 討論與結(jié)論

從76對SSR引物中篩選出29對多態(tài)引物對我國9個主要苧麻品種進行遺傳多樣性分析，研究結(jié)果表明，共檢測到152個位點，其中多態(tài)性位點為127個，占總擴增位點數(shù)的83.55%。每對引物檢測到2～11個位點，平均為4.38個，片段大小介于100～600 bp。Popgene分析表明Nei基因多樣性為0.337 1，Shannon信息指數(shù)為0.507 1。聚類分析結(jié)果表明9個苧麻品種的遺傳相似系數(shù)為0.58～0.78。在遺傳相似系數(shù)為0.62處可將全部材料分為A、B、C三大類。

SSR分子標記結(jié)果與系譜記載大體一致，可以將選育9個苧麻品種所用的原始親本間的交叉程度基本反映在聚類圖中親緣關(guān)系的遠近上，但也存在一些例外。如圓葉青和74-69均為湘苧一號經(jīng)輻射育種選育出的優(yōu)良品種,但在聚類圖中遺傳相似系數(shù)僅為0.62。這個結(jié)果與羅素玉等[14]研究結(jié)果相同。而在形態(tài)學上，圓葉青成熟莖綠褐色，葉片圓形，深綠色，雌花黃白色，發(fā)蔸慢，分株力弱；74-69成熟莖黃褐色，葉片卵圓形，綠色，雌蕊微紅色，發(fā)蔸較快，分株力中等。這2個品種在分子水平和形態(tài)學上均顯示出較大的差異性。B類中的中飼苧1號葉片多、莖稈細、麻皮薄、葉莖比大；鈣、粗蛋白、粗纖維、粗灰分、粗脂肪、維生素B2、賴氨酸等營養(yǎng)品質(zhì)高；耐肥能力強、生物產(chǎn)量高、前期生長快、適合一年內(nèi)多次收割。中飼苧1號具有特有的適宜做飼料的形態(tài)性狀和產(chǎn)量性狀，這可能是基因重組或者發(fā)生了較大的變異等所致。C類華苧4號是從稀節(jié)巴品種自然雜交后代中選育出的優(yōu)良品種。稀節(jié)巴是湖南省的地方品種，在其他供試苧麻品種的原始親本中都未用到，因此與其他品種的交叉程度較小，單獨聚為一類。

該研究聚類分析結(jié)果與系譜來源有較好的一致性，但也在分子水平上說明了供試材料遺傳基礎(chǔ)較狹窄。所選用的苧麻品種數(shù)量較少，選育品種所用的親本間存在不同程度的交叉，因此苧麻品種省份間的差異不顯著，遺傳多樣性指數(shù)不高。在今后的工作中，育種工作者可以加大親本選擇范圍，利用不同省份間的優(yōu)良地方品種培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的苧麻新品種，豐富苧麻栽培品種的遺傳多樣性。

[1]中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所.中國苧麻品種資源名錄 [M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1992.

[2]蔣彩虹,王元英,孫玉合.SSR和ISSR標記技術(shù)應用進展[J].中國煙草科學，2007，28（2）：1-5.

[3]趙慶勇，張亞東，朱 鎮(zhèn)，等.30個粳稻品種SSR標記遺傳多樣性分析[J].植物遺傳資源學報，2010，11（2）：218-223.

[4]李新海，傅駿驊，張世煌，等.利用SSR標記研究玉米自交系的遺傳變異[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2000，33（2）：1-9.

[5]Chen G,Du X M.Genetic Diversity of Source Germplasm of Upland Cotton in China as Determined by SSR Marker Analysis[J].Acta Genetica Sinica,2006,33（8）:733-745.

[6]Wang H Y,Wang X E,Chen P D.Assessment of Genetic Diversity of Yunnan,Tibetan,and Xinjiang Wheat Using SSR Markers[J].Journal of Genetics and Genomics,2007,34（7）:623-633.

[7]宗緒曉，關(guān)建平，王述民，等.中國豌豆地方品種SSR標記遺傳多樣性分析[J].作物學報，2008，34（8）：1330-1338.

[8]Zhang C Y,Chen X S,He T M,et al.Genetic Structure of Malus sieversii Population from Xinjiang,China,Revealed by SSR Markers[J].Journal of Genetics and Genomics,2007,34（10）:947-955.

[9]劉立軍，陳荷泉，蒙祖慶，等.44個苧麻栽培品種親緣關(guān)系的RAPD 分析[J].云南農(nóng)業(yè)大學學報，2006，21（10）：107-112.

[10]周建林，揭雨成，蔣彥波，等.用微衛(wèi)星DNA標記分析苧麻品種的親緣關(guān)系[J].作物學報，2004，3（30）：289-292.

[11]鄒自征，陳建華，欒明寶，等.應用RSAP、SRAP和SSR分析苧麻種質(zhì)親緣關(guān)系[J].作物學報，2012，38（5）：840-847.

[12]Chen J H,Luan M B,Song S F,et al.Isolation and characterization of EST-SSRs in the Ramie[J].African Journal of Microbiology Research.2011,21（5）:3504-3508.

[13]張 軍，武耀廷，郭旺珍，等.棉花微衛(wèi)星標記的PAGE/銀染快速檢測[J].棉花學報，2000，12（5）：267-269.

[14]羅素玉，唐守偉.苧麻核誘變育種技術(shù)及效果分析[J].核農(nóng)學報，1998，12（6）：337-341.