• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看

      ?

      河北省灤縣牛梨形蟲的分子檢測

      2012-10-10 02:53:40張香齋陳麗鳳王秋悅劉朋朋鄒亞學
      河北科技師范學院學報 2012年4期
      關鍵詞:牛巴梨形蟲病

      張香齋,陳麗鳳,陳 娟,王秋悅,劉朋朋,石 芳,鄒亞學

      (河北科技師范學院動物科技學院,河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室,河北秦皇島,066600)

      梨形蟲病是一類經(jīng)硬蜱傳播,由梨形蟲綱巴貝斯科或泰勒科原蟲引起的血液原蟲病的總稱。迄今為止,全世界已記載的各種哺乳動物的巴貝斯蟲有67種,泰勒蟲有13種[1]。牛梨形蟲病是世界性分布的嚴重危害養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的一類重要疾病,給畜牧業(yè)和國民經(jīng)濟造成巨大損失。在我國已報道的病原有牛巴貝蟲(Babesia bovis)、雙芽巴貝蟲(B.bigemina)、大巴貝蟲(B.major)、卵形巴貝蟲(B.ovata)、一種尚未命名的巴貝蟲(B.sp.)[2]、環(huán)形泰勒蟲(Theileria annulata)、瑟氏泰勒蟲(T.sergenti)和中華泰勒蟲(T.sinensis)[3]。牛梨形蟲病的傳播媒介蜱有3種:殘緣璃眼蜱(Hyalomma detritum)、長角血蜱(Haemaphysalis longicornis)和微小牛蜱(Boophihismicrophis)。據(jù)FAO統(tǒng)計,世界上有80%的牛遭到蜱的侵襲,僅硬蜱給畜牧業(yè)造成的損失,全球每年就高達70億美元[4]。本試驗應用PCR診斷技術,對采自河北省灤縣某牛場的牛進行梨形蟲檢測,以便了解和分析該地區(qū)梨形蟲自然感染狀況,為更好地防治該病提供一些參考。

      1 材料與方法

      1.1 試驗材料

      1.1.1 牛血液 采自河北省灤縣某牛場。

      1.1.2 主要試劑及緩沖液配制 50 ×TAE:取 Tris堿242 g,冰乙酸57.1 mL,0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)100 mL加入純水定容至1 L,儲存?zhèn)溆?蛋白酶K(德國Merck公司)、無水乙醇(天津市北方天醫(yī)化學試劑廠)、瓊脂糖(西班牙進口分裝)。PCR相關試劑,2×Taq MasterMix(北京康為世紀生物科技有限公司),引物(北京賽百盛生物技術有限責任公司)。DL2000(北京博潤德生物科技發(fā)展中心)。

      1.1.3 儀器設備 超級恒溫水浴箱(601型、金壇市醫(yī)療儀器廠)、高速臺式離心機(TGL-16G,上海安亭科學儀器廠)、可調微量移液器(0.1 ~2.5,5 ~50,100 ~1 000 μL,德國普蘭德)、梯度 PCR 儀(Mastercycler gradient,德國Eppendorf公司)、雙穩(wěn)定時電泳儀(DYY-6C型,北京六一儀器廠)、血液基因組小量提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司),基本常規(guī)儀器等均由河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室提供。

      1.2 試驗方法

      1.2.1 樣本 從唐山灤縣某牛場中抽檢28頭牛,靜脈抽血,加肝素抗凝,分裝入試管,放入冰盒帶回實驗室,保存待檢。

      1.2.2 模板DNA制備 使用血液基因組小量提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)按操作說明書操作。

      1.2.3 引物設計 根據(jù)GenBank上發(fā)表的環(huán)形泰勒蟲Tams1基因序列合成THX-F1/THX-R1和THXF2/THX-R2兩對引物;根據(jù)GenBank上已發(fā)表的牛瑟氏泰勒蟲P32表面蛋白基因序列,合成TSSH-F/TSSH-R引物對;根據(jù)文獻已發(fā)表的巴貝斯蟲18S rRNA基因序列[5,6],合成BSHY-F/BSHY-R引物對,用于雙芽巴貝斯蟲18S rRNA基因的擴增;合成NBBS-F1/NBBS-R1和NBBS-F2/NBBS-R2兩對引物對,用于其它巴貝斯蟲18S rRNA基因的擴增,引物名稱及序列見表1。以上梨形蟲中僅環(huán)形泰勒蟲為巢式PCR方法檢測,其余蟲種均為常規(guī)PCR方法檢測。

      1.2.4 PCR反應體系 PCR擴增均在20 μL反應體系中進行。該體系包括:2×Taq MasterMix 10 μL,上、下游引物各0.5 μL,模板各1.0 μL,超純水補足至20 μL。離心混勻后選擇適當?shù)姆磻獥l件在PCR擴增儀上進行擴增。

      表1 引物名稱及序列

      1.2.5 PCR 反應參數(shù)

      (1)環(huán)形泰勒蟲巢式PCR反應參數(shù):第1輪PCR反應:預變性94℃,3 min;變性94℃,1 min;退火55℃,1 min;延伸72℃,1 min,40個循環(huán),最后延伸72℃,7 min。第2輪PCR反應(以第1輪PCR產(chǎn)物為模板):預變性94℃,3 min;變性94℃,1 min;退火55℃,1 min;延伸72℃,1 min,30個循環(huán),最后延伸72℃,7 min。

      (2)瑟氏泰勒蟲PCR反應參數(shù):預變性95℃,3 min;變性95℃,2 min;退火63℃,2 min;延伸72℃,2 min,30 個循環(huán),最后延伸72 ℃,5 min。

      (3)牛雙芽巴貝斯蟲PCR反應參數(shù):預變性94℃,3 min;變性94℃,30 s;退火58.1℃,1 min;延伸72 ℃,1 min,32 個循環(huán),最后延伸72 ℃,5 min。

      (4)其他牛巴貝斯蟲PCR反應參數(shù):預變性95℃,3 min;變性95℃,2 min;退火63℃,2 min;延伸72℃,2 min;30個循環(huán),最后延伸72℃,5min。

      1.2.6 電泳檢測 反應結束后取5 μL擴增產(chǎn)物于質量濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳30 min,紫外燈下觀察結果并拍照。

      2 結果與分析

      本試驗檢測的28個樣本中,其中7個樣本擴增出了約1 700 bp(圖1,圖2)特異性條帶,雙芽巴貝斯蟲陽性樣本7份,陽性率為25.00%;3個樣本擴增出了約900 bp和1 300 bp兩條特異性條帶(圖3,圖4),其他牛巴貝斯蟲陽性樣本3份,陽性率10.71%;而環(huán)形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲均未檢測到陽性樣本。

      圖1 雙芽巴貝斯蟲18SrRNA基因擴增結果

      圖2 雙芽巴貝斯蟲18SrRNA基因擴增結果

      圖3 其他牛巴貝斯蟲18SrRNA基因擴增結果

      圖4 其他牛巴貝斯蟲18SrRNA基因擴增結果

      3 討 論

      梨形蟲病是一類必須通過硬蜱傳播的家畜血液原蟲病,侵襲牛的梨形蟲主要是牛雙芽巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲和牛泰勒蟲[7]。我國疆域遼闊,地跨古北、東洋兩大區(qū),從寒溫帶到熱帶,自然條件復雜,許多地區(qū)存在著大量可作為本病傳播媒介的硬蜱,因此我國家畜中梨形蟲種類較多,對畜牧業(yè)的威脅很大。羅建勛等獲得34個牛和羊的梨形蟲不同地區(qū)分離株,并對病原進行了分類鑒定,結果共分離到牛羊梨形蟲9種、21株,牛巴貝斯蟲未定種1株,羊巴貝斯蟲未定種7株,羊泰勒蟲未定種5株[6]。雙芽巴貝斯蟲,分布較廣,主要在南方各省;牛巴貝斯蟲,發(fā)現(xiàn)于貴州、安徽、湖南、陜西及河北等地;卵形巴貝斯蟲,發(fā)現(xiàn)于貴州、湖南、河南及吉林等地;環(huán)形泰勒蟲,分布較廣,主要在內蒙古及東北、西北各地;瑟氏泰勒蟲,發(fā)現(xiàn)于貴州、吉林、遼寧、河北、河南、湖南、云南、陜西、甘肅及寧夏。

      多年來,為了控制梨形蟲病,世界各國均開展了大量的研究工作,20世紀80年代以后,隨著現(xiàn)代分子生物學技術在這一領域的不斷應用,解決了許多應用經(jīng)典生物學技術難以證實或明確的問題,并為梨形蟲病的防治提供了很多新的理論和手段,取得了巨大的成果。國際上,對梨形蟲病的診斷方法己從血涂片檢查、補體結合試驗、間接熒光抗體發(fā)展到了DNA探針、PCR和酶聯(lián)免疫吸附實驗等更快速、準確的檢測方法。Martin-Sanchez等[8]建立了巢式PCR技術,將采集自牛環(huán)形泰勒蟲病不同流行地區(qū)的214份樣品分別用血涂片顯微鏡檢查、熒光抗體和PCR檢測,結果陽性率分為62.26%,69.86%,78.04%。顯然,PCR方法的檢出率高于其它兩種方法。本試驗參考的GenBank上發(fā)表的環(huán)形泰勒蟲Tams1基因序列、牛瑟氏泰勒蟲P32表面蛋白基因序列以及文獻已發(fā)表的巴貝斯蟲18S rRNA基因序列[9,10]合成的梨形蟲特異引物,現(xiàn)已廣泛用于種的鑒定和基因相關性的研究。本試驗采用PCR技術,對河北省灤縣某牛場采集的28份血樣進行梨形蟲檢測,結果顯示,??偢腥韭蕿?5%(7/28),感染牛中均有雙芽巴貝斯蟲感染(7/28),與其他牛巴貝斯蟲混合感染率為10.71%,表明河北省灤縣牛梨形蟲的自然感染情況較為嚴重,應給予高度重視。

      [1]蔣金書.動物原蟲病學[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社,2000.

      [2]羅建勛,殷宏,劉光遠,等.牛的巴貝斯蟲18S rRNA基因序列比較研究[J].畜牧獸醫(yī)學報,2005,36(9):906-911.

      [3]白啟,劉光遠,韓根鳳,等.在我國新發(fā)現(xiàn)的一種牛的泰勒蟲(Theilria)未定種[J].中國獸醫(yī)學報,1995,15(1):16-20.

      [4]SAUER J R,MCSWAIN J L,BOWMAN A S,et al.Tick salivary gland physiology[J].Annu Rev Entoml,1995,40:245-267.

      [5]王修文,林桌臣,危粹凡.貴州牛的原蟲初步調查與研究[J].貴州畜牧獸醫(yī)科技,1984(3):35-40.

      [6]羅建勛,殷宏,劉光遠,等.我國牛羊梨形蟲病病原的收集與鑒定[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,2006,24(增刊):48-53.

      [7]楊茂生,吳位珩,廖梅,等.牛梨形蟲病的診斷與防治[J].中國獸醫(yī)寄生蟲病,2008,16(2):48-49.

      [8]MARTIN-SANCHEZ J,VISERAS J,ADROHER F J,et al.Nested polymerase chain reaction for detection of Theileria annulata and comparison with conventional diagnostic techniques:its use in epidemiology studies[J].Parasitology Research,1999,85(3):243-245.

      [9]ALL SOPP M T,CAVALIER SMITH T,DE WAAL D T,et al.Phylogeny and evolution of the piroplasms[J].Parasitol,1994,108:147-152.

      [10]REDDY G R,CHAKRABARTI D,YOW ELL C A,et al.Sequence micro hetero geneity of the three small subunit ribosomal RNA genes of Babesia bigemina:expression in erythrocyte culture[J].Nucleic Acids Res,1991,19(13):3 641-3 645.

      猜你喜歡
      牛巴梨形蟲病
      玉林牛巴
      羊泰勒蟲病的臨床癥狀、剖檢變化和防治措施
      肉牛巴貝斯蟲病的流行病學、臨床癥狀、診斷和防治
      梨形頭畸形精子致病機制及相關研究進展*
      鯽魚黏孢子蟲病的診斷與防治
      牛貝諾孢子蟲病的發(fā)生、病理性診斷及防治
      印度梨形孢(Piriformosporaindica)的生物學特性及對植物生長的互作效應研究進展
      燈泡為什么做成梨形?
      奧秘(2016年3期)2016-03-23 21:59:52
      牛巴氏桿菌病的診斷與綜合防治
      牛巴貝斯蟲病的流行病學調查分析
      景东| 莱芜市| 康保县| 贵州省| 清水河县| 板桥市| 株洲县| 元谋县| 成武县| 红桥区| 闻喜县| 泉州市| 马鞍山市| 闻喜县| 永吉县| 油尖旺区| 五台县| 潢川县| 英超| 绥阳县| 金寨县| 道真| 乌拉特前旗| 图木舒克市| 汝城县| 海门市| 平武县| 临沭县| 大足县| 富锦市| 南宁市| 沙田区| 长乐市| 曲靖市| 永宁县| 平山县| 五华县| 昌宁县| 徐闻县| 根河市| 加查县|