鞏元芳，段玲欣，倪 靜，吳建華，任鐵艷王沛芳，劉錚鑄，李鳳敏

(1河北科技師范學(xué)院動物科技學(xué)院，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北秦皇島，066600;2河北省宣化縣職業(yè)技術(shù)教育中心)

微衛(wèi)星是20世紀(jì)80年代末期發(fā)展起來的一種新型DNA標(biāo)記，一般由1～6 bp的短核苷酸為核心序列，呈串聯(lián)重復(fù)狀分布于生物整個基因組，重復(fù)數(shù)在10～20次之間，具有分布廣泛、多態(tài)信息含量高、呈共顯性遺傳、穩(wěn)定性好、保守性強及檢測方便快速等特點而倍受青睞，被廣泛用于評估生物遺傳多樣性、構(gòu)建高分辨率的遺傳連鎖圖及復(fù)雜相關(guān)基因定位等的研究［1］。聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)在其持續(xù)發(fā)展和管理動物遺傳資源的戰(zhàn)略計劃中，也將微衛(wèi)星標(biāo)記作為優(yōu)先推薦的分析工具［2］。

長白豬原產(chǎn)于丹麥，原名蘭德瑞斯(Landrace)，是世界上第一個育成的最著名的瘦肉型品種，它是丹麥本地豬與英國大白豬雜交，經(jīng)過長期系統(tǒng)選育形成的，迄今已有70多年歷史。由于該品種具有適應(yīng)性好、生長快、遺傳性穩(wěn)定、飼料利用率高，而且母豬產(chǎn)仔數(shù)多、泌乳性能好、斷乳窩重較高以及胴體瘦肉產(chǎn)量高等優(yōu)點，所以在當(dāng)代世界范圍內(nèi)成為數(shù)量最多、分布最廣的一個瘦肉型品種［3］。

目前，對于長白豬，有關(guān)借助微衛(wèi)星標(biāo)記對其遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性方面的研究鮮有報道。基于以上研究背景，本研究利用3個微衛(wèi)星標(biāo)記在長白豬中進行遺傳多樣性的分析，以期為長白豬遺傳資源保護和合理的開發(fā)利用等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗豬群及樣品的采集

80頭長白豬來自于中國農(nóng)科院保種場，所有試驗豬身體健康，在常規(guī)飼養(yǎng)環(huán)境下飼養(yǎng)。用消毒過的耳號鉗采取3 mm×6 mm大小的耳組織2～3塊，放于盛有體積分?jǐn)?shù)為0．70的分析醇的EP管中，－20℃保存待用。

1．2 基因組DNA的提取

采用常規(guī)的酚-氯仿抽提法［4］。

1．3 微衛(wèi)星標(biāo)記的選擇

根據(jù)USDA-MARC(美國肉畜中心)最新豬微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳連鎖圖，選擇擴增效果好、多態(tài)信息含量大、重復(fù)次數(shù)多、等位基因數(shù)目在4個以上的微衛(wèi)星座位作為研究對象［5］。為了實現(xiàn)微衛(wèi)星多態(tài)性的熒光半自動檢測，必須對引物進行熒光修飾，即在上游引物的5’端加上發(fā)光基團。當(dāng)熒光引物擴增的PCR產(chǎn)物在ABI377測序儀上進行電泳檢測時，在激光的激發(fā)下熒光基團發(fā)光，系統(tǒng)自動收集熒光信號，從而獲得PCR產(chǎn)物的數(shù)據(jù)信息。所選微衛(wèi)星標(biāo)記的相關(guān)信息如表1和表2所示。

1．4 微衛(wèi)星標(biāo)記的PCR擴增及反應(yīng)條件

PCR 反應(yīng)總體積為 20．0 μL，其中 10 × buffer(含 15 mmol/L MgCl2的緩沖液)2．0 μL，dNTPs 1．6 μL，上下游引物(10 μmol/L 的引物)分別為0．4 μL，模板 DNA 1．0 μL，TaqDNA 聚合酶(5 ×106 U/L)0．1 μL，雙蒸水 14．5 μL。

PCR 反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55．8～66．8℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán);72℃總延伸10 min，最后4℃保存。

表1 3個微衛(wèi)星標(biāo)記的相關(guān)信息

1．5 電泳檢測

每次PCR反應(yīng)設(shè)不含模板的空白對照，擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為25 g/L的瓊脂糖凝膠電泳并在凝膠自動成像儀上檢測。

表2 3個微衛(wèi)星標(biāo)記的引物序列、退火溫度及熒光修飾情況

1．6 微衛(wèi)星基因型的分型

利用ABI377自動DNA測序儀和GeneScan V3．7軟件進行微衛(wèi)星基因型的檢測和分型。

1．7 數(shù)據(jù)的整理與統(tǒng)計分析

微衛(wèi)星呈共顯性遺傳，對測得的基因型做簡單統(tǒng)計即可計算出等位基因頻率［6］。本研究采用Pop-Gene32(ver1．31)軟件和自編程序進行了微衛(wèi)星基因座的群體遺傳變異分析，其中，進行了每個微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因頻率、有效等位基因數(shù)(Ne)和遺傳雜合度(H)的計算，用自編程序進行了多態(tài)信息含量(PIC)的計算。

式中，pi為第i個等位基因的頻率，n為等位基因數(shù)。

式中，pi為某一位點上第i個等位基因頻率，n為某一位點的等位基因數(shù)。

式中，pi，pj分別為群體中第i，j個等位基因頻率，n為等位基因數(shù)。

2 結(jié)果與分析

圖1 基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

2．1 基因組DNA的提取結(jié)果

基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，DNA條帶清晰，DNA量較大，點樣孔干凈，說明提取的豬基因組DNA無蛋白質(zhì)污染。

2．2 微衛(wèi)星標(biāo)記的基因型判定

2．2．1 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測結(jié)果 3個微衛(wèi)星標(biāo)記的擴增產(chǎn)物在25 g/L的瓊脂糖凝膠電泳上檢測，結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯?，每孔都有產(chǎn)物，且所有條帶濃度均勻一致，適合進行后期的GeneScan檢測。ESTMS20，SW2570和S0002的PCR產(chǎn)物網(wǎng)上公布分別在111～131 bp，152～178 bp和189～212 bp之間，而圖2(a)近100 bp有1條帶，圖2(b)在100 bp和200 bp之間有1條帶，圖2(c)在近200 bp有1條帶，這些結(jié)果與網(wǎng)上公布的基本一致。事實上后期經(jīng)GeneScan檢測在長白豬中ESTMS20的產(chǎn)物在113～135 bp之間，SW2570的產(chǎn)物在158～180 bp之間，S0002的產(chǎn)物在189～209 bp之間。

2．2．2 利用GeneScan V3．7軟件完成基因型的分型 圖3是3個微衛(wèi)星標(biāo)記經(jīng)GeneScan V3．7軟件識別后的等位基因情況，ESTMS20只有1個等位基因，SW2570和S0002均有2個等位基因。

2．3 3個微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因頻率、有效等位基因數(shù)(Ne)、遺傳雜合度(H)和多態(tài)信息含量(PIC)

觀察3個微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因頻率，各等位基因分布不均勻，每個微衛(wèi)星標(biāo)記都有其優(yōu)勢等位基因的存在(表3)。在3個微衛(wèi)星中，ESTMS20多態(tài)性最小，等位基因數(shù)為4個，以123 bp的頻率最高，其頻率為0．44。SW2570和S0002的等位基因數(shù)均為5個，而在SW2570的擴增結(jié)果中，158 bp頻率最高，其頻率為0．35，其次是178 bp，其頻率為0．33;在S0002的擴增結(jié)果中，207 bp的頻率最高，其頻率為0．75。另外，3個微衛(wèi)星標(biāo)記在長白豬群體中的遺傳雜合度為0．41～0．70;多態(tài)信息含量為0．38～0．65，有效等位基因數(shù)為 1．7 ～3．4。

3 討 論

圖2 3個微衛(wèi)星擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

有效等位基因數(shù)(Ne)是遺傳純合度的倒數(shù)，它表明等位基因間的相互影響，反映其實際作用的等位基因數(shù)目，也可以作為群體遺傳變異的一個測度。等位基因在群體中分布越均勻，有效等位基因數(shù)越接近檢測的等位基因絕對數(shù)［5］。由表3可以看出，本研究中的ESTMS20和SW2570在群體中分布比較均勻，而S0002中存在1個分布極顯著的等位基因(207 bp)，由此推測此等位基因在遺傳上起的作用可能更大一些。根據(jù)微衛(wèi)星的選擇標(biāo)準(zhǔn)［2，7］，每個微衛(wèi)星位點有4個等位基因，可以使每個位點的有效等位基因數(shù)大于2，本研究的3個微衛(wèi)星的有效等位基因數(shù)分別為3．3，3．4和1．7(接近于2)，由此表明這3個微衛(wèi)星均可用于長白豬遺傳多樣性的評估。

遺傳雜合度(H)的大小能近似反映出群體遺傳結(jié)構(gòu)和變異程度的高低。雜合度越高，群體的遺傳多樣性越高［5，8］。ESTMS20，SW2570和 S0002在長白豬中的雜合度分別為0．69，0．70 和0．41，平均雜合度為0．60，與 Nei等［9］報道的微衛(wèi)星雜合度(0．3～0．8)以及澤格·歐特［10］對基因雜合度不小于0．1的要求基本一致。由此可見，本研究的3個微衛(wèi)星標(biāo)記均具有較高的多態(tài)性。

多態(tài)信息含量(PIC)也是衡量位點多態(tài)性的一個重要指標(biāo)［5］，Bostein 等［6］和 Cooper等［11］均以 0．25 和 0．50 作為位點多態(tài)性高、中、低不同層次的分界標(biāo)準(zhǔn)，他們認(rèn)為當(dāng)PIC＞0．50時，標(biāo)記具有高度可提供的信息;當(dāng)0．25＜PIC ＜0．50，標(biāo)記能較合理的提供信息;當(dāng)PIC＜0．25，標(biāo)記提供的信息量較差，本研究中的3個微衛(wèi)星標(biāo)記在長白豬中的PIC分別為0．64，0．65和0．38，平均PIC為0．57，這又一次證明本研究的3個微衛(wèi)星在長白豬中均為高度多態(tài)位點。

綜上所述，長白豬群體內(nèi)的遺傳多樣性都比較豐富，具有較高的選擇潛力，所選3個微衛(wèi)星標(biāo)記能夠用于長白豬的群體遺傳多樣性的分析。本研究結(jié)果將為今后很好利用和開發(fā)長白豬提供較好的參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究采用ESTMS20，SW2570和S0002等3個微衛(wèi)星標(biāo)記對長白豬進行了遺傳多樣性的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個微衛(wèi)星標(biāo)記在長白豬中均具有多態(tài)性，基因雜合度分別為0．69，0．70和0．41，多態(tài)信息含量分別為0．64，0．68和0．38，由此推測，這3個微衛(wèi)星標(biāo)記在長白豬群體中屬于高度多態(tài)性座位，可以用于長白豬遺傳多樣性的評估。

圖3 3個微衛(wèi)星通過GeneScan V3．7軟件的判型結(jié)果

表3 3個微衛(wèi)星標(biāo)記在長白豬中的有效等位基因數(shù)(Ne)、遺傳雜合度(H)、多態(tài)信息含量(PIC)和等位基因頻率

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