孫憲迅，孫齊英，韓 雪，周理紅

（江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢430056）

膠原蛋白在食品、醫(yī)藥、美容等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，年增長率達(dá)到15%[1～5］。傳統(tǒng)的膠原蛋白制備方法是以豬、牛等陸生動物的皮和骨頭為原料進(jìn)行提取的。近年由于瘋牛病和口蹄疫等疾病的發(fā)生，使膠原蛋白的原料安全性受到質(zhì)疑。

羅非魚耐低氧，易養(yǎng)殖，在海水、淡水中均可養(yǎng)殖，已被視為傳統(tǒng)魚類的替代品種，是世界性的主要養(yǎng)殖魚類[6，7］。我國養(yǎng)殖羅非魚產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的50%以上，加工產(chǎn)生的羅非魚魚鱗逐年增加[8］。魚鱗中含有50%～70%的蛋白質(zhì)，主要為膠原蛋白和角蛋白。從魚鱗中提取膠原蛋白[6，9～14］，一般是在酶解前用酸、堿浸泡魚鱗以溶解無機(jī)鹽，這樣不可避免地產(chǎn)生了一定量的廢水，還造成部分蛋白質(zhì)損失[15～18］。

作者在此將羅非魚魚鱗用氣流式超微粉高速粉碎機(jī)粉碎后過篩，直接用堿性蛋白酶（Alcalase）酶解，酶解液經(jīng)濃縮、干燥，得到膠原蛋白粉。以膠原蛋白提取率為考核指標(biāo)，通過單因素實驗和正交實驗對酶解條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

羅非魚魚鱗，購自海南水產(chǎn)品市場。

堿性蛋白酶（2.4AU·g－1），諾維信（中國）公司。

RT－25小型氣流式超微粉高速粉碎機(jī)，紫外分光光度計，ZFQ 85－A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，LGL 05－2型真空冷凍干燥機(jī)。

1.2 工藝流程

羅非魚魚鱗→干燥→粉碎→過篩→Alcalase酶解→滅酶→過濾→取上清液→冷凍干燥→膠原蛋白粉

1.3 羅非魚魚鱗粉碎度對膠原蛋白提取的影響

稱取50g羅非魚魚鱗，用氣流式超微粉高速粉碎機(jī)粉碎后，分別用400目、300目、200目、160目、120目、100目、80目、60目的篩子過篩分級，各取1g羅非魚鱗粉，使魚鱗粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%，測定魚鱗粉碎度對膠原蛋白提取的影響。

1.4 單因素實驗

取粉碎度≥100目的魚鱗粉，分別考察羅非魚魚鱗粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)（3%、5%、7%、9%、11%、13%）、酶解溫度（50℃、55℃、60℃、65℃、70℃）、酶解pH 值（7.0、8.0、9.0、10.0、11.0）、酶加量（0.02AU·g－1、0.04AU·g－1、0.06AU·g－1、0.08AU·g－1、0.10 AU·g－1）、酶解時間（0.5h、1.0h、2.0h、3.0h）對膠原蛋白提取率的影響。除所研究因素外，其它各因素取基本值（酶解溫度60℃ ，酶解pH值9.0，羅非魚魚鱗粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%，酶加量0.04AU·g－1，酶解時間2.0h）。

1.5 正交實驗

參照文獻(xiàn)[10，12，16］，選擇酶解溫度、酶解 pH 值、酶加量、酶解時間為考察因素，以膠原蛋白提取率為考核指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交實驗，以優(yōu)化酶解條件。正交實驗的因素與水平見表1 。

表1 正交實驗的因素與水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.6 膠原蛋白提取率的測定

用凱氏定氮法分別測定膠原蛋白粉和原料中的氮含量，按下式計算膠原蛋白提取率。

2 結(jié)果與討論

2.1 魚鱗粉碎度對膠原蛋白提取率的影響（圖1）

圖1 魚鱗粉碎度對膠原蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of mesh of tilapia scale powder on extraction rate of collagen

由圖1可知，膠原蛋白提取率隨魚鱗粉目數(shù)的增大而升高。在60～100目，膠原蛋白提取率迅速升高；在100～400目，膠原蛋白提取率緩慢升高。這是因為，魚鱗粉碎后，破壞了魚鱗中膠原蛋白的主要保護(hù)組織羥基磷灰石的晶體結(jié)構(gòu)，使膠原蛋白能與酶接觸，充分酶解，當(dāng)粉碎度較大時，魚鱗粉顆粒越小，比表面積越大，酶吸附在魚鱗粉末的機(jī)會越多，反應(yīng)越徹底，膠原蛋白提取率越高；當(dāng)粉碎度較小時，魚鱗粉顆粒越大，酶與魚鱗接觸的面積越小，顆粒內(nèi)部的膠原蛋白不易與酶接觸，造成酶解效率低?？紤]到加工成本，選用魚鱗粉碎度為100目。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 羅非魚魚鱗粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對膠原蛋白提取率的影響（圖2）

由圖2可知，膠原蛋白提取率隨羅非魚魚鱗粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而降低，當(dāng)羅非魚魚鱗粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)從3%增加到7%時，膠原蛋白提取率緩慢降低；當(dāng)羅非魚魚鱗粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)從7%增加到9%時，膠原蛋白提取率迅速降低；之后，降幅趨緩。這是因為，增加羅非魚魚鱗粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)，酶解液粘度增大，影響酶與羅非魚魚鱗粉結(jié)合，酶解效果差，提取率下降；羅非魚魚鱗粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小時，酶解效果較好，膠原蛋白提取率較高?？紤]到下游的過濾與干燥成本，選擇羅非魚魚鱗粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%。

圖2 羅非魚魚鱗粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對膠原蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of mass fraction of tilapia scale powder on extraction rate of collagen

2.2.2 酶解溫度對膠原蛋白提取率的影響（圖3）

圖3 酶解溫度對膠原蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on extraction rate of collagen

由圖3可知，膠原蛋白提取率隨酶解溫度的升高先升高后降低，在酶解溫度為60℃時達(dá)到最高。這是因為，高溫使維持酶分子結(jié)構(gòu)的次級鍵解體，導(dǎo)致酶蛋白變性，從而使得酶活性減弱或喪失。因此，選擇酶解溫度為60℃。

2.2.3 酶解pH值對膠原蛋白提取率的影響（圖4）

由圖4可知，膠原蛋白提取率隨酶解pH值的增大先升高后降低，在酶解pH值為9.0時達(dá)到最高。因此，選擇酶解pH值為9.0。

2.2.4 酶加量對膠原蛋白提取率的影響（圖5）

由圖5可知，膠原蛋白提取率隨酶加量的增大先升高后降低，在酶加量為0.06AU·g－1時，膠原蛋白提取率較高，但與酶加量為0.04AU·g－1相比升幅很小。因此，選擇酶加量為0.04AU·g－1。

2.2.5 酶解時間對膠原蛋白提取率的影響（圖6）

圖6 酶解時間對膠原蛋白提取率的影響Fig.6 Effect of enzymolysis time on extraction rate of collagen

由圖6可知，酶解0.5～2.0h內(nèi)，膠原蛋白提取率迅度升高；之后，隨著酶解時間的延長，膠原蛋白提取率升幅不明顯。這是因為，2.0h以后，提取液中蛋白質(zhì)濃度高，粘性大，阻止了酶與底物的進(jìn)一步接觸和膠原蛋白的溶出，即使繼續(xù)延長酶解時間，上清液中的膠原蛋白含量也不會明顯升高。綜合考慮，選擇酶解時間為2.0h。

2.3 正交實驗結(jié)果與分析（表2 ）

表2 正交實驗結(jié)果與分析Tab.2 Results and analysis of orthogonal experiment

由表2 可知，各因素對膠原蛋白提取率的影響大小依次為A＞D＞C＞B，即酶解溫度＞酶解時間＞酶加量＞酶解pH值。堿性蛋白酶酶解羅非魚魚鱗制備膠原蛋白的最優(yōu)水平組合為A3B1C3D2，即最佳酶解條件為：酶解溫度65℃、酶解pH值8.5、酶加量0.05 AU·g－1、酶解時間2.0h。

在上述最佳酶解條件下進(jìn)行驗證實驗，膠原蛋白提取率達(dá)95.79%。

3 結(jié)論

采用堿性蛋白酶直接酶解羅非魚魚鱗制備膠原蛋白，通過單因素實驗和正交實驗，確定最佳酶解條件為：100目羅非魚魚鱗粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%、酶解溫度65℃、酶解pH值8.5、酶加量0.05AU·g－1、酶解時間2.0h，在此條件下，膠原蛋白提取率達(dá)95.79%。該方法具有產(chǎn)率高、環(huán)境友好等優(yōu)點，適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

[1]張俊杰，曾慶孝.魚鱗的開發(fā)利用前景[J］.中國水產(chǎn)，2004，（5）：74－75.

[2]Karim A A，Bhat R.Fish gelgatin：Properties，challenges，and prospects as an alternative to mammalian gelatins[J］.Food Hydrocolloids，2009，23（3）：563－576.

[3]曹俊.魚鱗膠原蛋白的研究進(jìn)展和應(yīng)用前景[J］.水產(chǎn)科技情報，2009，36（1）：41－44.

[4]Pati F，Adhikari B，Dhara S.Isolation and characterization of fish scale collagen of higher thermal stability[J］.Bioresoure Technology，2010，101（10）：3737－3742.

[5]Sankar S，Sekar S，Mohan R，et al.Preparation and partial characterization of collagen sheet from fish（Lates calcarifer）scales[J］.International Journal of Biological Macromolecules，2008，42（1）：6－9.

[6]宋芹，顏軍，郭曉強(qiáng)，等.酶法制取羅非魚魚鱗膠原蛋白寡肽的工藝[J］.食品研究與開發(fā)，2011，32（4）：39－43.

[7]邸剛.關(guān)于我國羅非魚產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的探討[J］.中國漁業(yè)經(jīng)濟(jì)，2002，（4）：17－18.

[8]張海明.羅非魚的養(yǎng)殖及其發(fā)展前景[J］.飼料廣角，2004，（11）：40－43.

[9]吳雷，劉章武.魚鱗粗膠原蛋白提取工藝研究[J］.武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2011，30（4）：12－16.

[10]劉艷，劉章武，唐婧苗，等.酶法提取4種淡水魚魚鱗膠原蛋白的研究[J］.水產(chǎn)科學(xué)，2010，29（4）：221－224.

[11]周光朝，劉良忠，萬菡，等.魚鱗酶解前處理工藝優(yōu)化研究[J］.武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2010，29（3）：1－10.

[12]涂宗財，陳劍兵，劉偉，等.酶解魚鱗膠制備小分子多肽的工藝的研究[J］.食品科學(xué)，2005，26（8）：210－213.

[13]申鋒，楊莉莉，熊善柏，等.胃蛋白酶水解草魚魚鱗制備膠原肽的工藝優(yōu)化[J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，29（3）：387－391.

[14]鐘朝輝，李春美，梁晉鄂，等.魚鱗膠原蛋白提取工藝的優(yōu)化[J］.食品科學(xué)，2006，27（7）：162－166.

[15]張俊杰，段蕊，薛婉麗，等.鯉魚魚鱗在鹽酸脫鈣過程中的變化[J］.氨基酸和生物資源，2009，31（1）：44－47.

[16]韓冰，石彥國，張根生，等.Alcalase蛋白酶制備鯉魚魚鱗膠原多肽[J］.食品科學(xué)，2009，30（24）：51－55.

[17]Wang L，An X X，Yang F M，et al.Isolation and charaeterisation of collagens from the skin，scale and bone of deep－sea redfish（Sebastes mentella）[J］.Food Chemistry，2008，108（2）：616－623.

[18]Sugiura H，Yunoki S，Kondo E，et al.In vivo biological responses and bioresorption of tilipia scale collagen as a potential biomaterial[J］］.Biomater Sci Polym Ed，2009，20（10）：1353－1368.