宗文明,葉 紅

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽 合肥 230036；2.安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，安徽 合肥 230061）

禽類MHCⅡ類分子β鏈信號肽保守性分析

宗文明1,葉 紅2

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽 合肥 230036；2.安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，安徽 合肥 230061）

Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）的β鏈顯示極為豐富的多態(tài)性.為了分析禽類MHCⅡ類分子β鏈信號肽是否呈現(xiàn)出多態(tài)性的分子生物學(xué)特征，利用NCBI網(wǎng)站查找到原雞等五種禽類編碼MHCⅡ類分子β鏈的mRNA，再用DNAStar軟件轉(zhuǎn)譯成氨基酸序列，然后用信號肽在線預(yù)測軟件SignalP 3.0 Server進(jìn)行分析，得出信號肽的概率、信號肽的長度以及信號肽酶的酶切位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)這五種禽類MHCⅡ類分子β鏈信號肽的分子生物學(xué)特征有許多相似性，利用Mega4.1軟件進(jìn)行信號肽氨基酸序列比對分析，揭示出禽類MHCⅡ類分子β鏈信號肽具有高度的保守性.

禽類；MHC；信號肽；保守性

為什么有些蛋白質(zhì)（如線粒體、葉綠體等的蛋白質(zhì)）在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中合成，而有些（如分泌性蛋白質(zhì)、膜蛋白等）在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成，是什么指令確定蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的合成部位以致最終影響蛋白質(zhì)的定向轉(zhuǎn)位呢？1975年，G.Blobel和D.Sabatini在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上提出了信號肽假說，即蛋白質(zhì)N端存在一段信號肽，指導(dǎo)蛋白質(zhì)遷移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成，蛋白質(zhì)合成結(jié)束前信號肽被信號肽酶切除[1].

隨著生物信息學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，對蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測分析已成為生物信息學(xué)的重要組成部分，同時(shí)也為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供相應(yīng)的理論依據(jù)，使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更具目的性及有效性.信號肽對于控制蛋白質(zhì)的分泌路徑和指導(dǎo)蛋白質(zhì)定位特定位置有著重要作用，全面系統(tǒng)地研究信號肽不僅有助于認(rèn)識、分析和解釋各種生理和病理現(xiàn)象，而且在尋求基因診療的新藥領(lǐng)域信號肽已經(jīng)成為一個(gè)關(guān)鍵工具[2].MHCⅡ類分子是由α鏈和β鏈組成的異二聚體，屬膜蛋白，其中β鏈顯示極為豐富的多態(tài)性.本文利用NCBI網(wǎng)站查找到原雞等五種禽類的編碼MHCⅡ類分子β鏈蛋白的mRNA序列，運(yùn)用信號肽在線預(yù)測軟件SignalP 3.0和DNAStar進(jìn)行分析，探討禽類MHCⅡ類分子β鏈信號肽序列的分子生物學(xué)特征，以發(fā)現(xiàn)它們是否呈現(xiàn)出多態(tài)性.

1 材料

1.1 mRNA序列

來源于NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫，網(wǎng)址為http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

1.2 序列編輯軟件

DNAStar，網(wǎng)址為 http://www.torrents.net/.

1.3 信號肽預(yù)測網(wǎng)站

SignalP3.0，網(wǎng)址為http://www.cbs.dtu.dk/services/.

1.4 序列比對軟件

Mega4.1.

2 方法

2.1 查找序列

利用NCBI網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫，查找得到具有完整CDS(Coding sequence，編碼序列)的編碼五種禽類即原雞，綠頭鴨，鴻雁，鵪鶉，雉雞五種禽類編碼MHCⅡ類分子β鏈的mRNA序列.

2.2 查找開放閱讀框

利用DNAStar的EditSep對五條序列進(jìn)行分析，查找相應(yīng)的開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)(表1)，并將核苷酸序列翻譯為氨基酸序列.

表1 五種禽類β鏈Genebank登錄號及ORF長度

2.3 分析氨基酸序列

使用SignalP 3.0 Server分析ORF的N端氨基酸序列，根據(jù)從SignalP中分析獲取的Cmax值 (the cleavage site score)、Smean 值(the signal peptide score)和 HMM 值(hidden Markov model)判定是否存在信號肽，并測出信號肽酶切位點(diǎn)，從而確定信號肽序列存在區(qū)段；

2.4 分析信號肽序列的保守性

五條禽類MHCⅡ類分子β鏈信號肽氨基酸序列用Mega軟件進(jìn)行比對，分析氨基酸的保守位點(diǎn).

3 結(jié)果與分析

3.1 五種禽類MHCⅡ類分子β鏈信號肽分析

SignalP 3.0 Server是基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (Neural Networks，NN)和隱馬可夫模型(Hidden Markov，HMM)兩種算法預(yù)測原核生物和真核生物蛋白質(zhì)信號肽的軟件.前者預(yù)測值表示為Smean，后者預(yù)測值表示為Sprob[3].運(yùn)用信號肽分析軟件SignalP 3.0分析原雞(Gallus gallus)MHCⅡ類分子β鏈的信號肽存在情況(圖1)，SignalP-HMM的結(jié)果表明，該編碼序列含有信號肽的概率為99.9%；SignalP-NN的結(jié)果表明，該編碼序列含有能被信號肽酶切除的信號肽，酶切位點(diǎn)在第26，27位氨基酸之間，N端前26個(gè)氨基酸為信號肽區(qū)，進(jìn)一步用DNAStar的EditSep分析信號肽的氨基酸序列，結(jié)果表明26個(gè)氨基酸中，有17個(gè)非極性氨基酸，占65.38%；6個(gè)極性氨基酸，占23.08%；3個(gè)帶正電荷的堿性氨基酸，占13.04%.

圖1 原雞MHCⅡβ鏈的信號肽分析

運(yùn)用信號肽分析軟件SignalP 3.0分析綠頭鴨(Anas platyrhynchos)MHCⅡ類分子β鏈信號肽存在情況 (圖2).SignalP-HMM結(jié)果表明，該編碼序列含有信號肽的概率為99.2%，SignalP-NN的結(jié)果表明，該編碼序列含有能被信號肽酶切除的信號肽，酶切位點(diǎn)在第26，27位氨基酸之間，N端前26個(gè)氨基酸為信號肽區(qū)，進(jìn)一步用DNAStar的EditSep分析信號肽的氨基酸序列，結(jié)果表明26個(gè)氨基酸中，有16個(gè)非極性氨基酸，占61.54%；8個(gè)極性氨基酸，占30.77%；2個(gè)帶正電荷的堿性氨基酸，占7.69%.

圖2 綠頭鴨MHCⅡβ鏈的信號肽分析

圖3 鴻雁MHCⅡβ鏈的信號肽分析

運(yùn)用信號肽分析軟件SignalP 3.0分析鴻雁(Anser cygnoides)MHCⅡ類分子β鏈信號肽存在情況 (圖3).SignalP-HMM結(jié)果表明，該編碼序列含有信號肽的概率為99.3%，SignalP-NN的結(jié)果表明，該編碼序列含有能被信號肽酶切除的信號肽，酶切位點(diǎn)在第26，27位氨基酸之間，N端前26個(gè)氨基酸為信號肽區(qū)，進(jìn)一步用DNAStar的EditSep分析信號肽的氨基酸序列，結(jié)果表明26個(gè)氨基酸中，有16個(gè)非極性氨基酸，占61.54%；8個(gè)極性氨基酸，占30.77%；2個(gè)帶正電的堿性氨基酸，占7.69%.

運(yùn)用信號肽分析軟件SignalP 3.0分析鵪鶉(Coturnix japonica)MHCⅡ類分子β鏈的信號肽存在情況(圖4).SignalP-HMM結(jié)果表明，該編碼序列含有信號肽的概率為99.9%，SignalP-NN的結(jié)果表明，該編碼序列含有能被信號肽酶切除的信號肽，酶切位點(diǎn)在第26，27位氨基酸之間，N端前26個(gè)氨基酸為信號肽區(qū)，進(jìn)一步用DNAStar的EditSep分析信號肽的氨基酸序列，結(jié)果表明26個(gè)氨基酸中，有17個(gè)非極性氨基酸，占65.38%；7個(gè)極性氨基酸，占26.92%；2個(gè)帶正電的堿性氨基酸，占7.69%.

圖4 鵪鶉MHCⅡβ鏈的信號肽分析

運(yùn)用信號肽分析軟件SignalP 3.0分析雉雞(Phasianus colchicus)MHCⅡ類分子β鏈的信號肽存在情況(圖5).SignalP-HMM結(jié)果表明，該編碼序列含有信號肽的概率為99.9%，SignalP-NN的結(jié)果表明，該編碼序列含有能被信號肽酶切除的信號肽，酶切位點(diǎn)在第26，27位氨基酸之間，N端前26個(gè)氨基酸為信號肽區(qū)，進(jìn)一步用DNAStar的EditSep分析信號肽的氨基酸序列，結(jié)果表明26個(gè)氨基酸中，有18個(gè)非極性氨基酸，占69.23%；6個(gè)極性氨基酸，占23.07%；2個(gè)帶正電的堿性氨基酸，占7.69%.

圖5 雉雞MHCⅡβ鏈的信號肽分析

總結(jié)以上五條禽類MHCⅡ類分子β鏈信號肽生物信息學(xué)的分析結(jié)果(表2)，表明五條禽類MHCⅡ類分子β鏈含有信號肽概率均在0.99以上，說明禽類MHCⅡ類分子β鏈N端均含有信號肽，且信號肽長度均為26個(gè)氨基酸，酶切位點(diǎn)在第26，27位氨基酸之間.因此，可以確定五條禽類MHCⅡ類分子β鏈的N端前26個(gè)氨基酸是信號肽區(qū).五條鏈中從第8位到第21位的氨基酸全部都是疏水性氨基酸，說明從第8位到第21位的氨基酸是信號肽的疏水核心區(qū)，而且信號肽酶切位點(diǎn)處的氨基酸殘基是親水性氨基酸殘基，具有ARG-X的模式(R為A或Y或G，X表示親水性氨基酸殘基).

表2 禽類MHCⅡ類分子β鏈信號肽生物信息學(xué)分析

3.2 禽類MHCⅡ類分子β鏈信號肽的保守性分析

五條禽類MHCⅡ類分子β鏈信號肽氨基酸序列用Mega軟件進(jìn)行比對，如圖6.

圖6 五條禽類MHCⅡ類分子β鏈信號肽的氨基酸序列比較保守性氨基酸殘基用紅色矩形框標(biāo)出

結(jié)果表明，禽類MHCⅡ類分子β鏈信號肽的26個(gè)氨基酸中共有17個(gè)位點(diǎn)的氨基酸相同，占信號肽氨基酸總數(shù)的65.4%，保守的氨基酸分別是第一位的甲硫氨酸，第2、4位的甘氨酸，第5位的精氨酸，第9、11位的丙氨酸，第12位的纈氨酸，第13位的亮氨酸，第14位的纈氨酸，第15位的丙氨酸，第16、19位的亮氨酸，第20位的甘氨酸，第21位的甘氨酸，第22位的丙氨酸，第23位的精氨酸，第25位的丙氨酸，第27位的甘氨酸.禽類MHCⅡ類分子β鏈信號肽的26個(gè)氨基酸中有16～18個(gè)非極性氨基酸，6～8個(gè)極性氨基酸，2～3個(gè)帶正電的堿性氨基酸，26個(gè)氨基酸中有17個(gè)位點(diǎn)的氨基酸相同，這說明五種禽類MHCⅡ類分子β鏈的信號肽具有高度的保守性.

4 討論

信號肽位于蛋白質(zhì)的N端，一般由16～26個(gè)氨基酸殘基，其中包括疏水核心區(qū)、信號肽的C端和N端3部分.當(dāng)信號肽序列合成后，被信號識別顆粒(SRP)所識別，蛋白質(zhì)合成暫停或減緩，信號識別顆粒將核糖體攜帶至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，蛋白質(zhì)合成重新開始.在信號肽的引導(dǎo)下，新合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，而信號肽序列則在信號肽酶的作用下被切除[4-6].

MHCⅡ類分子作為重要的免疫分子，主要作用是識別和提呈外源性抗原肽，進(jìn)而激活T淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答.MHCⅡ類分子的生物合成起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，初步加工后便離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到達(dá)高爾基體，在高爾基體中繼續(xù)進(jìn)行蛋白質(zhì)的修飾與加工，然后再進(jìn)一步運(yùn)輸至早期/晚期溶酶體，在溶酶體內(nèi)與外源性抗原肽結(jié)合，再通過膜泡運(yùn)送到細(xì)胞表面[7,8]，供T淋巴細(xì)胞識別.在MHCⅡ類分子的生物合成中信號肽對于控制蛋白質(zhì)的分泌路徑和指導(dǎo)蛋白質(zhì)定位特定位置有重要意義.

運(yùn)用信號肽分析軟件SignalP3.0對五條禽類MHCⅡ類分子β鏈信號肽氨基酸序列進(jìn)行分析可知，五條禽類MHCⅡ類分子β鏈均含有明確的信號肽，即前26個(gè)氨基酸是信號肽區(qū)，第8至21位是由中性氨基酸構(gòu)成的疏水區(qū)，符合信號肽的特征.MHCⅡ分子具有豐富的多態(tài)性和多基因性，通過分析五條禽類MHCⅡ類分子β鏈的信號肽氨基酸序列可知MHCⅡ類分子β鏈的信號肽的26個(gè)氨基酸中有17個(gè)氨基酸位點(diǎn)是高度保守的，說明禽類MHCⅡ類分子β鏈的信號肽具有高度保守性，并且它們執(zhí)行相似的功能，即指導(dǎo)MHCⅡ類分子β肽鏈從細(xì)胞質(zhì)中遷移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中繼續(xù)合成.

信號肽的分析對利用標(biāo)簽蛋白研究目的蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)和定位有重要意義，根據(jù)信號肽的存在與否才能確定報(bào)告基因與目的基因的上游還是下游融合，進(jìn)而避免標(biāo)簽蛋白與目的蛋白N端的信號肽區(qū)同時(shí)被信號肽酶切除，使得融合基因的表達(dá)不僅很好地保留熒光蛋白的特性，而且同時(shí)也保證了目的蛋白在細(xì)胞中的定位功能[9].

〔1〕翟中和,王喜忠,丁明孝.細(xì)胞生物學(xué)(第 3 版)[M].北京:高等教育出版社,2007.200～215.

〔2〕劉惠,楊杰,陳軍，等.基于全序列比對相似度預(yù)測信號肽[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào),2008（42）:11～15.

〔3〕孫平楠,周小玲,王正祥.信號肽生物信息學(xué)分析在Neurospora crassa phyA基因鑒定中的應(yīng)用[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009（6）:1098～1101.

〔4〕彭佳師,龔繼明.信號肽與蛋白質(zhì)的分選轉(zhuǎn)運(yùn)[J].植物生理學(xué)報(bào),2011（47）:9～17.

〔5〕譚曉林,劉朝奇,鄭蘭英.信號肽對酵母外源蛋白質(zhì)分泌效率的影響[J].生物技術(shù),2010（3）:10～16.

〔6〕孫翰昌,龐敏,靳濤.斑馬魚成纖維細(xì)胞生長因子（FGFs）信號肽的預(yù)測分析[J].中國獸醫(yī)雜志,2010（6）:33～35.

〔7〕Neumann J,Koch N.Assembly of major histocompatibility complex classⅡsubunits with invariant chain[J].FEBS Letters,2005,579:6055～6059.

〔8〕Busch R,Cloutier I,Sekaly RP,et al.Invariant chain protects classⅡhistocompatibility antigens from binding intactpolypeptidesin the endoplasmic reticulum [J].EMBO J,1996,15:418～428.

〔9〕葉紅.新城疫病毒F蛋白-Ii嵌合體與MHC分子結(jié)合特性的研究[D].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.63.

S858

A

1673-260X（2012）08-0020-04

安徽省高校省級科研重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2012A104）