李青川,高玉榮
(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,大慶163319)
在當(dāng)今的經(jīng)濟(jì)發(fā)展中,乙醇廣泛應(yīng)用于化學(xué)工業(yè)、食品、醫(yī)藥及軍事等領(lǐng)域[1]。目前,世界各國日益重視能源問題,燃料乙醇由于其可再生性,被認(rèn)為是最有可能代替石油的液體燃料[2]。因此燃料乙醇的需求量迅速增加,市場(chǎng)潛力十分巨大。
大豆糖蜜是大豆?jié)饪s蛋白生產(chǎn)過程的副產(chǎn)物,其含糖量可達(dá)40%以上[3],目前,大豆糖蜜主要作為飼料添加劑添加于飼料中,未能進(jìn)行大規(guī)模的深加工利用。目前,在我國酒精的產(chǎn)量中,主要以玉米、谷物、薯類、糧食與經(jīng)濟(jì)作物發(fā)酵[4]。利用大豆糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)乙醇,不僅有利于緩解我國糧食緊張的壓力,降低生產(chǎn)成本,而且能促進(jìn)大豆?jié)饪s蛋白生產(chǎn)企業(yè)副產(chǎn)品的有效利用。
優(yōu)良的酵母菌株是決定乙醇產(chǎn)量的重要因素。為了獲得適合利用大豆糖蜜進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)乙醇的菌株,擬從大豆糖蜜中,篩選發(fā)酵性能優(yōu)良的乙醇生產(chǎn)菌株,并進(jìn)行生長(zhǎng)特性的研究,以期為以大豆糖蜜為原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇提供高產(chǎn)菌株。
1.1 材料
1.1.1 樣品來源
大豆糖蜜:黑龍江雙河松嫩生物科技有限公司提供。
1.1.2 培養(yǎng)基
1.1.2.1 增殖培養(yǎng)基:自制麥芽汁液體培養(yǎng)基,12 °Brx,自然 pH。
1.1.2.2 分離培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基):葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母提取物1%,瓊脂2%,自然pH值,121℃滅菌20 min。
1.1.2.3 活化培養(yǎng)基:葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母提取物1%,自然pH值,121℃滅菌20 min。
1.1.2.4 TTC下層培養(yǎng)基:20%糖蜜,瓊脂2%,121℃滅菌20 min。
1.1.2.5 TTC上層培養(yǎng)基:葡萄糖0.5%,瓊脂1.5%,加水加熱溶解,吸取9.5 mL加入到試管中121℃滅菌20 min,加入5%TTC濃溶液使其濃度為0.5%,混勻。
1.1.2.6 生長(zhǎng)培養(yǎng)基:經(jīng)3 000 r·min-1離心處理10 min處理后的大豆糖蜜,121℃滅菌20 min。
1.1.3 主要儀器和設(shè)備
SYQ·DMSX-280手提式壓力蒸汽消毒器;LRH-150 S恒溫恒濕培養(yǎng)箱;ZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱;752紫外可見分光光度計(jì);分析天平(感量0.000 1 g);全玻璃蒸餾器;水浴鍋。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 酵母菌的富集及分離
吸取1 mL大豆糖蜜液放于加有玻璃珠的20 mL增殖培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中,于28℃、100 r·min-1培養(yǎng)24 h。吸取1 mL含菌增殖培養(yǎng)基進(jìn)行十倍梯度稀釋至1×10-6;分別吸取0.1 mL稀釋液涂布于TTC下層培養(yǎng)基上,28±1℃倒置培養(yǎng)3~5 d。
1.2.2 酵母菌的篩選
1.2.2.1 TTC平板法初篩
將融化并冷卻到45~50℃的TTC上層培養(yǎng)基,倒入菌落數(shù)量在100個(gè)左右的TTC平板上,28±1℃培養(yǎng)箱中避光保溫3 h,取顯色效果好的菌株接于YPD固體斜面培養(yǎng)基上[5]。
1.2.2.2 耐乙醇酵母菌的篩選
將顯色效果好的菌株斜面2環(huán),接入裝有加有玻璃珠的20 mL增殖培養(yǎng)基中,28℃、100 r·min-1培養(yǎng)24 h。吸取9.5 mL增殖培養(yǎng)基放于試管中,放入杜氏小管并排出氣體。在無菌操作條件下加無水乙醇,使乙醇濃度(v/v)分別為 12%、14%、16%、18%和20%,接種0.5 mL菌液接種于各試管中,28℃培養(yǎng)72 h,每天時(shí)觀察產(chǎn)氣情況,選擇產(chǎn)氣快且量大的菌株作為后續(xù)試驗(yàn),并傳接于分離培養(yǎng)基中[6]。
1.2.2.3 高產(chǎn)乙醇酵母菌的篩選
取耐乙醇能力強(qiáng)的菌株的斜面菌種,挑取2環(huán)接入加有玻璃珠的20 mL增殖培養(yǎng)基中,28℃、100 r·min-1培養(yǎng)18 h。錐形瓶中分別裝入45 mL糖濃度為30%的生長(zhǎng)培養(yǎng)基,接種菌懸液5 mL,在28 ℃、100 r·min-1發(fā)酵 24 h 后,靜置發(fā)酵至 72 h,測(cè)定發(fā)酵液中的乙醇含量。
1.2.3 篩選菌株生長(zhǎng)條件研究
1.2.3.1 最適生長(zhǎng)糖濃度的測(cè)定
取篩選出來的高產(chǎn)乙醇的菌株,在增殖培養(yǎng)基經(jīng)28 ℃、100 r·min-1活化培養(yǎng) 18 h后,將 5%(v/v)種子液分別接入糖濃度為2%、4%、6%、8%、10%的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中,裝液量為 40 mL/250 mL,28 ℃、100 r·min-1振蕩培養(yǎng)18 h后,測(cè)定其生物量。
1.2.3.2 最佳接種量的測(cè)定
取篩選出來的高產(chǎn)乙醇的菌株,在增殖培養(yǎng)基經(jīng) 28℃、100 r·min-1活化培養(yǎng) 18 h后,分別將1%、2%、3%、4%、5%(v/v)的種子液接入到 1.2.3.1中所確定的最佳糖濃度的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中,裝液量為40 mL/250 mL,28 ℃,100 r·min-1振蕩培養(yǎng)18 h后,測(cè)定其生物量。
1.2.3.3 最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定
取篩選出來的高產(chǎn)乙醇的菌株,在增殖培養(yǎng)基經(jīng)28 ℃、100 r·min-1活化培養(yǎng) 18 h后,將 5%(v/v)種子液接入1.2.3.1中所確定的最佳糖濃度的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中,裝液量為 40 mL/250 mL,分別在 24、26、28、30、32℃,100 r·min-1振蕩培養(yǎng)18 h后,測(cè)定其生物量。
1.2.3.4 最適生長(zhǎng)pH值的測(cè)定
取篩選出來的高產(chǎn)乙醇的菌株,在增殖培養(yǎng)基經(jīng)28 ℃、100 r·min-1活化培養(yǎng) 18 h 后,將 5%(v/v)種子液接入1.2.3.1中所確定的最佳糖濃度的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中,裝液量為40 mL/250 mL,生長(zhǎng)培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)為 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0,28 ℃、100 r·min-1振蕩培養(yǎng)18 h后,測(cè)定其生物量。
1.2.3.5 轉(zhuǎn)速對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響
在增殖培養(yǎng)基經(jīng)28℃、100 r·min-1活化培養(yǎng)18 h后,將5%(v/v)種子液接入1.2.3.1中所確定的最佳糖濃度的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中,裝液量為40 mL/250 mL,28 ℃下,分別在 80、100、120、140、160 r·min-1的轉(zhuǎn)速條件振蕩培養(yǎng)18 h后,測(cè)定其生物量。
1.2.3.6 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
將最適接種量的種子增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)液接入到最適種子生長(zhǎng)培養(yǎng)基中,最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng),每隔2 h測(cè)定其生物量[7]。
1.3 檢測(cè)方法
乙醇含量的測(cè)定方法:蒸餾法[8]。
糖含量的測(cè)定方法:用手持式糖度計(jì)測(cè)定。
生物量的測(cè)定方法:采用比濁法,將發(fā)酵液混勻后稀釋一定倍數(shù),測(cè)定其在600 nm 的吸光度(OD600)[9]。
2.1 酵母菌的分離篩選
從大豆糖蜜中共分離得到12 個(gè)平板1 380 株菌供一級(jí)篩選。
2.1.1 TTC 平板法初篩
經(jīng)避光保溫培養(yǎng)后,觀察比較TTC 平板中各菌株的顏色深淺,顏色比較深的菌株說明其呼吸酶活力強(qiáng),產(chǎn)酒精能力較強(qiáng),共挑出具有典型酵母菌菌落特征顯色較深的的菌株156 株,進(jìn)行耐乙醇能力的測(cè)定。
2.1.2 耐乙醇酵母菌的篩選
從TTC 平板法初篩得到的菌株中篩選耐乙醇能力強(qiáng)的菌株。通過觀察菌株在含不同濃度乙醇的培養(yǎng)基中發(fā)酵程度的強(qiáng)弱,即在杜氏小管中氣泡產(chǎn)生的快慢與多少,可知其對(duì)乙醇耐受能力。到72 h 時(shí)觀察到,各菌株的在20%的乙醇濃度的發(fā)酵管里菌株B1、B2、B3、B5、B6、T1、T2、T4、T5、T6、P11、P14 仍 有著不同的產(chǎn)氣情況,說明這些菌株比其它菌株具有更強(qiáng)的乙醇耐受能力,其產(chǎn)生乙醇的能力也可能會(huì)更大。
2.1.3 高產(chǎn)乙醇酵母菌的篩選
對(duì)耐乙醇能力強(qiáng)的菌進(jìn)行產(chǎn)乙醇能力的測(cè)定。由表1 可看出,P14 的乙醇濃度最高,達(dá)到9.07%(v/v)。
表1 乙醇含量測(cè)定結(jié)果Table 1 The results of the ethanol content determination
2.2 P14 生長(zhǎng)條件研究
2.2.1 最適生長(zhǎng)糖濃度的測(cè)定
酵母菌利用大豆糖蜜中的糖作為生長(zhǎng)所需的養(yǎng)分,糖濃度過低會(huì)導(dǎo)致酵母菌因養(yǎng)分不充足而生長(zhǎng)緩慢,糖濃度過高又會(huì)使培養(yǎng)基的滲透壓增大,從而抑制酵母菌的增殖。由圖1 可看出,大豆糖蜜的糖濃度對(duì)P14 的生長(zhǎng)影響顯著,當(dāng)糖濃度達(dá)到12%時(shí)P14 生長(zhǎng)最旺盛,生物量最大。因此,確定大豆糖蜜糖濃度為12%作為P14 的最適生長(zhǎng)糖濃度。
2.2.2 最佳接種量的測(cè)定
種子接種量的大小對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)影響顯著。由圖2 可看出,接入不同量的種子液后,經(jīng)過18 h 的培養(yǎng),不同接種量的培養(yǎng)液呈現(xiàn)了不同的OD600 值,接種量為1%~4%時(shí),OD600 值隨接種量的增加而增加,當(dāng)接種量達(dá)到5%時(shí),OD600 值則出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)。因此,P14 的最適接種量為4%。
2.2.3 最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定
溫度對(duì)菌種生長(zhǎng)影響顯著,低溫生長(zhǎng)速度慢,高溫菌種容易衰老死亡。由圖3 可看出,在不同溫度的條件下經(jīng)過 18 h、100 r ·min-1 的培養(yǎng),26 ℃時(shí)培養(yǎng)液的OD600 值出現(xiàn)了最高值。因此,選26℃作為P14的最佳生長(zhǎng)溫度。
2.2.4 最適生長(zhǎng)pH 值的測(cè)定
酵母菌在其生長(zhǎng)過程中,生長(zhǎng)環(huán)境的pH 值過高或過低都會(huì)影響酵母菌細(xì)胞膜表面基團(tuán)的解離,從而進(jìn)一步影響到對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和自身代謝物的分泌。由圖4 可看出,在不同pH 值的培養(yǎng)基中培養(yǎng),隨著pH 值從4.5 增加到7.0 時(shí),在6.0 處出現(xiàn)了最高值,但OD600 值的趨勢(shì)線比較平緩,pH 值對(duì)其影響不顯著。因此,選取6.0 作為P14 的最適生長(zhǎng)pH。這與培養(yǎng)基的自然pH 值接近。
2.2.5 最佳生長(zhǎng)轉(zhuǎn)速的測(cè)定
轉(zhuǎn)速是影響到培養(yǎng)基中的可溶性氧含量的另一個(gè)因素,因此培養(yǎng)過程中合適的轉(zhuǎn)速可為酵母菌的快速生長(zhǎng)補(bǔ)充充足的氧分。由圖5 可見,140 r ·min-1時(shí)OD600 值最大,因此選取140 r ·min-1 作為P14 的搖瓶轉(zhuǎn)速。
2.2.6 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
在進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)時(shí),應(yīng)選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體,在此階段細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,代謝活性強(qiáng),繁殖快,個(gè)體形態(tài)、化學(xué)組成、生理特性等均較為穩(wěn)定、一致。由圖6 可看出,菌株P(guān)14 沒有生長(zhǎng)的延滯期,從培養(yǎng)的一開始便進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,當(dāng)培養(yǎng)到16 h 后,OD600 值基本趨于穩(wěn)定;當(dāng)培養(yǎng)到24 h 時(shí),其生物量開始減少,說明從22 h 開始進(jìn)入了衰亡期。由P14 的生長(zhǎng)特性可知,在糖濃度12%的大豆糖蜜培養(yǎng)基中,控制pH 值6.0,發(fā)酵溫度26℃,轉(zhuǎn)速140 r ·min-1,培養(yǎng)16 h 可獲得最佳的種子。
3.1 采用TTC 平板法、乙醇耐性測(cè)定以及產(chǎn)乙醇性能三級(jí)篩選,從大豆糖蜜中分離的1 380 株野生菌中,篩選到1 株可耐受20%(v/v)乙醇、初始發(fā)酵的乙醇濃度達(dá)9.07%的菌株P(guān)14。可為大豆糖蜜的發(fā)酵生產(chǎn)乙醇提供優(yōu)良的菌種。
3.2 研究確定了該菌的最佳生長(zhǎng)條件為糖濃度12%,接種量4%,生長(zhǎng)溫度26℃,pH 6.0,轉(zhuǎn)速140 r ·min-1。在此條件下,培養(yǎng)16 h 后獲得最佳的種子培養(yǎng)液。
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