MALDI-TOF-MS 技術(shù)篩查原發(fā)性小肝細(xì)胞癌血清特異蛋白

李 珂，何偉華，趙 光，獨建庫，孫高斌，彭 玲，高春芳

基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption/ionization-time of flightmass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術(shù)主要應(yīng)用在蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究并直接獲取某種疾病的特征性生物學(xué)標(biāo)記。目前，利用MALDI-TOF-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)腫瘤的特殊生物學(xué)標(biāo)記，對多種腫瘤的早期診斷研究中顯示出良好的應(yīng)用前景[1-6]。原發(fā)性肝癌（primary hepatocellular carcinoma，PHC）是國內(nèi)外最常見的惡性腫瘤之一，肝癌在我國的發(fā)病率及病死率有逐年增高的趨勢[7，8]。中晚期肝癌診斷并不困難，但臨床治療預(yù)后不佳，故肝癌早期診斷即小肝癌診斷對肝癌治療及預(yù)后起著至關(guān)重要的作用，也一直被臨床和科研工作者所關(guān)注。尋找具有高靈敏度和高特異性的原發(fā)性肝癌特異性腫瘤標(biāo)志物則是原發(fā)性肝癌早期診斷的關(guān)鍵所在。運用MALDI-TOF-MS技術(shù)對原發(fā)性小肝癌患者與正常人血清蛋白質(zhì)譜進(jìn)行分析，得到高敏感性和特異性的血清蛋白，建立小肝癌診斷模型指紋圖譜，為肝癌的臨床治療及預(yù)后評估提供更積極的因素。

1 資料與方法

1.1 對象及分組 選取解放軍第150醫(yī)院2007-09～2009-12收治的小肝癌患者35例 （均未做任何干預(yù)性治療），影像學(xué)報告肝腫瘤直徑<5 cm（以2001年中華醫(yī)學(xué)會定義小肝癌標(biāo)準(zhǔn)，不嚴(yán)格區(qū)分微小肝癌與小肝癌），且超聲引導(dǎo)經(jīng)皮穿刺活檢病理診斷報告為原發(fā)性肝癌；男23例，女12例，男女比例 1.92∶1；年齡 27～79 歲，平均 56 歲；按照 TNM 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，Ⅰ期34例，Ⅱ期1例；按照Child-Pugh分級標(biāo)準(zhǔn)，A級30例，B級5例；甲胎蛋白（AFP）<20μg/L 者 5例， 20～200μg/L者 17例，>200μg/L者13例；有乙型肝炎、肝硬化病史29例。正常對照組共50名，為2007-09～2010-09健康體檢者，男 31名，女 19名，男女比例 1.6∶1；年齡 25～83歲，平均58歲（對照組年齡與小肝癌組年齡無統(tǒng)計學(xué)差異）；AFP正常，均無肝炎及肝硬化病史。

1.2 試劑儀器及方法

1.2.1 試劑儀器 試劑為銅螯合磁珠懸浮液、銅螯合磁珠結(jié)合緩沖液 （BS）、銅螯合磁珠清洗緩沖液（WS）、銅螯合磁珠洗脫緩沖液（ES）基質(zhì)（3mg/ml CHCA，50%ACN，2%TFA）等。 儀器為 Eppendorf公司的磁珠分離器、微量加樣槍、高速臺式離心機、SCOUT-MTP樣品靶、AUTOFLEX TOF/TOF質(zhì)譜儀及Revco公司的超低溫冰箱、通風(fēng)櫥等。

1.2.2 方法 患者空腹抽取肱靜脈血2～3ml于普通干燥管中，4 ℃冰箱內(nèi)靜置 2 h，離心（2000 r/min，10～20min），取上清按 100μl/管分裝標(biāo)記，置于-70℃超低溫冰箱保存。樣品靶、血清樣品進(jìn)行結(jié)合前生化處理后，血清蛋白與標(biāo)準(zhǔn)靶進(jìn)行結(jié)合：取樣品10μl置于1.5ml離心管中，混勻磁珠懸浮液后取出5μl磁珠加入樣品管，再加入50μl銅螯合磁珠結(jié)合緩沖液（BS），將樣品管放入磁珠分離器，在前后相鄰兩孔間反復(fù)移動樣品管10次混勻；分離后用加樣槍小心吸去樣品管中的溶液，向樣品管中加入20μl銅螯合結(jié)合緩沖液使磁珠重新懸浮、分離；再向樣品管中加入100μl銅螯合磁珠清洗緩沖液 （WS），在磁珠分離器前后相鄰兩孔間反復(fù)移動樣品管10次混勻；向樣品管中加入10μl銅螯合磁珠洗脫緩沖液（ES）混勻，磁珠與洗脫液分離，用加樣槍小心將洗脫下來的多肽樣品溶液移入干凈的0.5ml樣品管；點1μl洗脫樣品及1μl基質(zhì)于樣品靶。

1.2.3 質(zhì)譜檢測 將制備好的SCOUT-MTP樣品靶通過AUTOFLEX TOF/TOF質(zhì)譜儀檢測口放入質(zhì)譜儀內(nèi)部托盤并固定。啟動激光系統(tǒng)提供脈沖激光，擊打樣品靶點，通過flex Control的Setup設(shè)置儀器參數(shù)，當(dāng)激光開始脈沖時，數(shù)字轉(zhuǎn)換器記錄由檢測器檢測到的模擬信號，并將它們轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號。采集系統(tǒng)運用FlexControl軟件，設(shè)定激光能量、譜圖評估參數(shù)、譜圖疊加次數(shù)、靶的移動方式和范圍等參數(shù)。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析系統(tǒng)采用FlexAnalysis和BioTools兩組軟件，分組調(diào)入樣品數(shù)據(jù)建立模型，實驗選擇線性模式，再設(shè)定參數(shù)選擇算法，包括快速分類法（quick classifier，QC）、遺傳算法（genetic algorithm，GA）、支持向量機法（support vector machine，SVM）及監(jiān)督神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法（supervised neural network，SNN）等，運算后顯示統(tǒng)計分析結(jié)果并進(jìn)行交叉驗證。

2 結(jié) 果

2.1 蛋白質(zhì)譜波峰的整合分析 軟件FlexAnalysis和BioTools分析結(jié)果顯示：蛋白質(zhì)質(zhì)荷比（M/Z）在0～100000Da范圍內(nèi)（共 169 個 Index），小肝癌組與正常人組有差異的蛋白質(zhì)峰為55個（P<0.05，表1），兩組有顯著性差異的蛋白質(zhì)峰為30個（P<0.01）。

2.2 分類結(jié)果 小肝癌組和正常對照組血清樣品的蛋白質(zhì)波譜進(jìn)行比較，根據(jù)GA得到的蛋白質(zhì)如表2所示，SVM得到的蛋白質(zhì)如表3所示，QC得到的蛋白質(zhì)如表4所示，SNN所得的蛋白質(zhì)如表5所示。

2.3 交叉驗證 通過交叉驗證（表6）及識別能力檢測 （表7）顯示GA較其它三種算法結(jié)果可信度高。GA識別的M/Z值為7771.17Da的蛋白質(zhì)較具有較高敏感性和特異性，可將正常人及小肝癌患者準(zhǔn)確分開。

2.4 確定診斷模型蛋白 運用MALDI-TOF分析結(jié)果顯示，M/Z值為7771.17 Da的蛋白質(zhì)作為診斷原發(fā)性小肝癌的特異性蛋白可將正常人及小肝癌患者準(zhǔn)確分組，具有高敏感性和特異性。且M/Z值為7771.17Da蛋白質(zhì)在小肝癌組中低表達(dá)，在正常人組中高表達(dá)。

2.5 特異性及敏感性的相關(guān)分析 運用Flex Analysis和BioTools軟件進(jìn)行分析，M/Z值為7771.17Da的蛋白質(zhì)作為診斷原發(fā)性小肝癌的特異

性蛋白，其敏感性為91.0%，特異性為70.0%。

表1 小肝癌組與正常人對照組有55個差異蛋白質(zhì)

表2 GA結(jié)果

表3 QC結(jié)果

表4 SVM結(jié)果

表5 SNN結(jié)果

表6 交叉驗證

表7 識別能力檢測

3 討 論

肝癌早期診斷即小肝癌診斷對肝癌治療及預(yù)后起著至關(guān)重要的作用，肝癌的早期篩查有助于降低肝癌病死率[9]。近年，隨著實驗室技術(shù)及影像診斷技術(shù)的發(fā)展，原發(fā)性肝癌的診斷已經(jīng)從“臨床診斷”進(jìn)展到“亞臨床診斷”。20世紀(jì)70年代初，甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein，AFP）的臨床應(yīng)用使肝癌診斷向前邁進(jìn)了一大步。然而，大量臨床資料表明肝癌患者AFP陽性率波動于60%～70%[10]，小肝癌中血清AFP陰性的肝癌患者也較常見[11]，且部分肝癌患者病程中AFP值呈持續(xù)低濃度陽性。同時，正常妊娠、活動性肝炎、生殖系統(tǒng)和胃腸系統(tǒng)的惡性腫瘤等血清AFP值亦升高。以上表明甲胎蛋白在原發(fā)性小肝癌診斷的實際應(yīng)用中，存在相當(dāng)程度的陰性及假陽性問題。20世紀(jì)80年代，超聲（ultrasonic）、計算機斷層攝影（CT）、核磁共振成像（MRI）等影像診斷技術(shù)的應(yīng)用使肝癌的亞臨床診斷成為可能。同樣，以上任何一種影像診斷技術(shù)都受到儀器性能、腫瘤發(fā)展程度、影像學(xué)技師技能、臨床經(jīng)驗等因素的影響，且影像診斷篩查結(jié)果最終需得到病理診斷的進(jìn)一步支持。

近期，關(guān)于肝癌的基礎(chǔ)研究也是十分活躍據(jù)，然而肝癌發(fā)生的機理十分復(fù)雜，至今發(fā)現(xiàn)的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)異常雖然多見，但尚未據(jù)此形成更為可靠的預(yù)測手段[12]。生命科學(xué)進(jìn)入后基因組時代為科研工作者提供了更高的平臺，從多肽、核酸、純化蛋白質(zhì)等基因水平探討一種疾病的發(fā)生發(fā)展已經(jīng)提上日程。如何尋找具有高靈敏度和高特異性的蛋白質(zhì)是原發(fā)性小肝癌早期診斷的關(guān)鍵所在，采用基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜 （MOLDI-TOF-MS）技術(shù)對原發(fā)性小肝癌患者與正常人血清蛋白質(zhì)譜進(jìn)行分析，得到高敏感性和特異性的血清蛋白，且能將小肝癌與正常人較準(zhǔn)確的分開，建立診斷模型指紋圖譜，為小肝癌的臨床診斷及治療提供積極因素。

本研究利用MOLDI-TOF-MS技術(shù)和Flex Analysis和BioTools分析軟件，對35例原發(fā)性小肝癌血清標(biāo)本與50名正常人血清樣本進(jìn)行對比，結(jié)果顯示：在0～100000 Da質(zhì)荷比范圍內(nèi)，小肝癌組與正常人組有顯著性差異的蛋白質(zhì)峰為55個 （P<0.05），兩組有非常顯著性差異的蛋白質(zhì)峰為30個（P<0.01）；通過交叉驗證，結(jié)果以M/Z值為7771.17 Da的蛋白質(zhì)，具有較高敏感性和特異性，可將正常人及小肝癌患者準(zhǔn)確分開，且M/Z值為7771.17Da蛋白質(zhì)在小肝癌組中低表達(dá)，在正常人組中高表達(dá)。再以M/Z值為7771.17 Da蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)記，隨機抽取小肝癌與正常人血清標(biāo)本進(jìn)行雙盲驗證，結(jié)果表明此蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)記物可以將肝臟腫瘤與非腫瘤準(zhǔn)確地分組，其敏感性為91.0%，特異性為70.0%。

[1]Wardwell NR,Massion PP.Novel strategies for the early detection and prevention of lung cancer[J].Semin Oncol,2005,32(3):259-268.

[2]Li J,Zhang Z,Rosenzweig J,et al.Proteomics and bioinformatics approaches for identification of serum biomarkers to detect breast cancer[J].Clin Chem,2002,48(12):1296-1304.

[3]Gretzer MB,Chan DW,van Rootselaar CL,et al.Analysis of dunning prostate cancer cell lines with variable metastatic potential using MOLDI-TOF-TOF[J].The Prostate,2004,60(3):325-331.

[4]Wadsworth JT,Somers KD,Stack BC Jr,et al.Identification of patients with head and neck cancer using serum protein profiles[J].Arch Otolarygol Head Neck Surg,2004,130(1):98-104.

[5]Ebert MP,Meuer J,Wiemer JC,et al.Identification of gastric cancer patients by serum protein profiling[J].Proteome Res,2004,3(6):1261-1266.

[6]Rosty C,Christa L,Kuzdzal S,et al.Identification of hepatocarcinoma-intestine-pancreas/pancreatitis-associated protein I as a biomarker for pancreatic ductal adenocarcinoma by protein biochip technology[J].Cancer Res,2002,62(6):1868-1875.

[7]Bosch FX,Ribes J,Díaz M,et al.Primary liver cancer:worldwide incidence and trends[J].Gastroenterology,2004,127(Suppl):S5-16.

[8]Lai EC,Lau WY.The continuing challenge of hepatic cancer in Asia[J].Surgeon,2005,3(3):210-215.

[9]Zhang BH,Yang BH,Tang ZY.Randomized controlled trial of screening for hepatocellular carcinoma[J].J Cancer Res Clin Oncol,2004,130(7):417-422.

[10]吳孟超，陳 漢，沈 鋒.原發(fā)性肝癌的外科治療-附5524例報告[J].中華外科雜志，2001，39(1):25-28.

[11]Nomura F,Ishijima M,Kuwa K,et al.Serum des-gammacarboxy prothrombin levels determined by a new generation of sensitive immunoassays in patients with small-sized hepatocellular carcinoma[J].Am J Gastroenterol,1999,94(3):650-654.

[12]吳孟超.肝癌外科治療的近期進(jìn)展[J].中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2006,13(2):125-128.