高壓微射流處理對(duì)大豆分離蛋白構(gòu)象及功能特性的影響

沈 蘭，王昌盛，唐傳核*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

高壓微射流處理對(duì)大豆分離蛋白構(gòu)象及功能特性的影響

沈 蘭，王昌盛，唐傳核*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

通過測(cè)定溶解度、乳化性、疏水性和運(yùn)用差示掃描量熱儀分析(DSC)和圓二色光譜(CD)分析探討不同壓力微射流處理(HPM)對(duì)大豆分離蛋白(SPI)構(gòu)象和功能特性的影響。HPM誘導(dǎo)不溶性蛋白聚合物解聚，增加SPI的溶解度、乳化活性指數(shù)和疏水性。DSC圖譜結(jié)果表明，處理后的SPI變性溫度基本維持不變，但變性焓值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。CD光譜分析表明，HPM對(duì)SPI的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)沒有明顯的影響。

大豆分離蛋白；高壓微射流；功能特性；構(gòu)象

大豆蛋白以其較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的功能特性，已經(jīng)成為目前世界上最大的具有商業(yè)價(jià)值的植物蛋白。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)建設(shè)的飛速發(fā)展，人們生活水平的日益提高，大豆蛋白常作為添加劑來改善食品的品質(zhì)，在食品、醫(yī)藥保健食品、嬰兒食品和飲料食品等領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng)用。然而，商用大豆蛋白的功能特性通常較差，很大程度地限制了其應(yīng)用范圍[1]。

高壓技術(shù)被認(rèn)為是一種環(huán)境友好的物理改性手段，目前有高壓微射流、高靜壓和傳統(tǒng)動(dòng)態(tài)高壓處理。在樣品高壓微射流處理過程中，高速流動(dòng)的蛋白質(zhì)溶液快速通過具有一定幾何形狀的腔體，物料同時(shí)受到高速剪切、高頻振蕩、空穴效應(yīng)和對(duì)流撞擊等機(jī)械力作用和相應(yīng)的熱效應(yīng)，由此引發(fā)的機(jī)械力化學(xué)效應(yīng)可誘導(dǎo)生物大分子物理、化學(xué)及結(jié)構(gòu)性質(zhì)的變化[2]。由于其處理的時(shí)間短，溫度低，效果獨(dú)特，被認(rèn)為是很有發(fā)展前景的一種低溫物理加工方法[3]。Sathe[4]利用動(dòng)態(tài)超高壓微射流技術(shù)制備了亞微米級(jí)的乳狀液；Iordache等[5]探討了高壓微射流處理對(duì)變性乳蛋白質(zhì)溶液粒徑、功能特性以及解聚行為的影響，研究表明高壓微射流處理可以降低蛋白質(zhì)的粒徑，誘導(dǎo)不溶性聚集物解聚，改善蛋白溶解特性?；诖耍芯扛邏何⑸淞魈幚韺?duì)大豆分離蛋白(SPI)功能特性和構(gòu)象的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆粕 山東禹王有限公司；大豆色拉油(食品級(jí))中糧食品營(yíng)銷有限公司；牛血清白蛋白(BSA) Fitzgerald公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

M-110EH高壓微射流納米均質(zhì)機(jī) 美國(guó)Microfluidics公司；F-7000熒光分光光度計(jì)、CR22G高速冷凍離心機(jī)日本Hitachi公司；MOS-450圓二色光譜儀 法國(guó)Bio-Logic公司；2501PC紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；Q100差示掃描量熱儀 美國(guó)TA Insruments公司；IKAT25高速分散機(jī) 德國(guó)IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白(SPI)的制備

大豆分離蛋白(SPI)的制備采用經(jīng)典的堿提-酸沉工藝[6]，并稍作改動(dòng)。稱取100g大豆粕粉分散于1.5L去離子水(1∶15，m/V)中，用2mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至8.0，在室溫下攪拌2h，離心(8000×g，30min，4℃)，棄其沉淀物。將上清液pH值調(diào)到4.5，離心(5000×g，20min，4℃)。棄其上清液，所得沉淀物經(jīng)兩次水洗(pH4.5)后，分散于適量的去離子水中，調(diào)pH值至7.5。充分溶解后置于去離子水透析24h，冷凍干燥后于－20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 高壓微射流處理

稱取一定量的SPI溶解于去離子水中，配成5g/100mL的SPI溶液。采用高壓微射流納米均質(zhì)機(jī)，對(duì)其進(jìn)行均質(zhì)處理，分別于0、40、80、120、160MPa條件下循環(huán)均質(zhì)3次。處理后的蛋白溶液冷凍干燥，－20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 溶解度測(cè)定

將不同壓力處理的樣品分別配成1.0g/100mL不同pH值的蛋白溶液，pH值范圍設(shè)置為2.0～10.0。充分溶解后，離心(10000×g，30min，15℃)[7]。上清液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)物做標(biāo)準(zhǔn)曲線。SPI的溶解度表示為上清液蛋白質(zhì)量濃度占總蛋白質(zhì)量濃度的百分比。樣品在0.1mol/L NaOH溶液中的溶解度記為總蛋白質(zhì)量濃度[8]。

1.3.4 乳化特性測(cè)定

在測(cè)定小燒杯中分別加入15mL 0.1g/100mL蛋白質(zhì)溶液(pH值分別為3.0、5.0、7.0、9.0)和5mL玉米油，利用高速分散機(jī)經(jīng)24000×g處理1min后，從測(cè)試管底部取出50μL乳液，用0.1g/100mL的SDS稀釋100倍(5mL)，于500nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度A500nm。

乳化活性指數(shù)(emulsifying activity index，EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(emulsifying stability index，ESI)的計(jì)算公式分別如下[9]：

式中：A0為吸光度；DF為稀釋因子，DF=100；ρ為蛋白質(zhì)量濃度/(g/mL)；φ為光程(φ=0.01m)；θ為油相所占分?jǐn)?shù)(θ=0.25)；A0、A10分別為0min和10min時(shí)在500nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.5 表面疏水性測(cè)定

將一定量待測(cè)蛋白樣品溶于10mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)中，配制成質(zhì)量濃度為1.5g/100mL蛋白質(zhì)溶液。分別移取10、20、30、40、50μL的蛋白溶液加入到4mL的磷酸緩沖溶液(pH7.0)中。在測(cè)試前添加20μL 8mmol/L ANS儲(chǔ)備液，振蕩均勻，在室溫下反應(yīng)8～15min。樣品的熒光強(qiáng)度(fluorescence intensity，F(xiàn)I)采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定。測(cè)試條件為：激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別390nm和470nm，激發(fā)和發(fā)散狹縫寬均為5nm。以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的FI為縱坐標(biāo)做圖，其斜率即為蛋白質(zhì)的疏水性指數(shù)H0。

1.3.6 熱學(xué)特性分析

熱學(xué)特性用差示掃描量熱儀分析測(cè)定。稱取約2mg蛋白樣品置于鋁盒中，加入10μL 10mmol/L磷酸緩沖溶液(pH7.0)充分?jǐn)噭蚝髩罕P。以空鋁盒為對(duì)照，溫度掃描范圍：30～120℃；升溫速率：5℃/min；保護(hù)氮?dú)饬魉伲?0mL/min。采用Theunivers2000分析軟件計(jì)算蛋白質(zhì)的熱力學(xué)參數(shù)，其中，to為起始變性溫度；td為最大變性溫度；t1/2為半峰寬；ΔH為變性焓。結(jié)果為3次測(cè)量的平均值。

1.3.7 構(gòu)象分析

樣品的構(gòu)象變化采用圓二色光譜儀進(jìn)行測(cè)定。將掃描波長(zhǎng)設(shè)定190～250nm遠(yuǎn)紫外區(qū)域，用于研究不同蛋白樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)。稱取5mg蛋白樣品溶于5mL磷酸緩沖溶液(10mmol/L，pH7.0)，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笥?0000×g離心10min。將上清液稀釋至0.1mg/mL，用于二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定。所用樣品池的光徑為2mm，測(cè)量溫度設(shè)為25℃，測(cè)定時(shí)所用的分辨率為0.5nm，掃描速度為100nm/min，靈敏度為100(m·deg)/cm，實(shí)驗(yàn)值為3次掃描的平均值。

將波長(zhǎng)設(shè)定于250～320nm近紫外區(qū)域可用于蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定。配制蛋白質(zhì)量濃度為1mg/mL，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笥?0000×g離心20min，取上清液用于三級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定。所用樣品池的光程為10mm，測(cè)量溫度設(shè)為25℃，測(cè)定時(shí)所用的分辨率為0.5nm，掃描速度為100nm/min，靈敏度為100(m·deg)/cm，實(shí)驗(yàn)值為3次掃描平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆分離蛋白的溶解度

圖1 高壓微射流處理后大豆分離蛋白的溶解度-pH值變化曲線Fig.1 Protein solubility-pH curves of HPM-treated SPIs

溶解性是蛋白質(zhì)水化作用的重要體現(xiàn)。溶解性數(shù)據(jù)對(duì)天然來源蛋白質(zhì)的提取、純化和分離條件的確定至關(guān)重要，為蛋白質(zhì)的可應(yīng)用性提供一個(gè)良好的指標(biāo)[1]。從圖1 可以看出，高壓微射流處理可以改善蛋白質(zhì)的溶解特性，這種改善依賴于所施加的壓力及pH值。在各pH值條件下樣品的溶解度均隨著壓力的增加而增加。在酸性條件下改善程度并不明顯，但在堿性條件下，0～80MPa范圍內(nèi)溶解度增加幅度較大，80～160MPa范圍內(nèi)的改善程度則與酸性條件下類似，變化很小。胡寶松等[3]運(yùn)用超高壓射流在0～140MPa內(nèi)研究SPI的功能性質(zhì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)pH8的條件下，SPI的溶解度在0～80MPa條件下變化較大，而在80～140MPa條件下溶解度變化很小，這與該實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。尹壽偉等[2]采用高壓微射流研究蕓豆分離蛋白也得出了類似的結(jié)論。這可能是因?yàn)?～80MPa條件下，高壓微射流的高速剪切處理使SPI的不溶性聚集體解聚，使之成為更小的蛋白膠團(tuán)顆粒，從而增大了SPI與水的接觸面積；另一方面，SPI的立體結(jié)構(gòu)變得松散，蛋白質(zhì)分子有一定程度的解離和伸展，從而暴露出更多的極性基團(tuán)，因此溶解度也得到改善。而在80～160MPa條件下，由于大量活性基團(tuán)的暴露，使得蛋白質(zhì)分子間又相互形成新的化學(xué)鍵，導(dǎo)致溶解度變化不大。

2.2 大豆分離蛋白乳化特性

蛋白質(zhì)的乳化特性與其溶解度、表面疏水性和表面電荷分布相關(guān)。在蛋白質(zhì)溶解度較低的情況下，溶解度是決定蛋白質(zhì)乳化特性的主要因素；而在蛋白質(zhì)溶解度較高的情況下，表面疏水性是決定蛋白質(zhì)乳化性的主要因素[10]。

圖2 高壓微射流處理大豆分離蛋白在不同pH值條件下的EAI(A)和ESI(B)Fig.2 Effect of HPM treatment on EAI and ESI of SPI

蛋白質(zhì)的乳化特性可通過乳化活性指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)來表征[2]。樣品的EAI和ESI與pH值的關(guān)系如圖2A、B所示。從圖2A可以看出，同一pH值條件下，EAI隨著壓力的增高而顯著增大，這主要?dú)w因于高壓微射流使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)松散，暴露出更多的親水性基團(tuán)，使得親水性提高；與此同時(shí)分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)也暴露出來，親油性也增強(qiáng)，兩者達(dá)到較好的平衡[11]。

ESI則在酸性條件下變化不明顯，在pH7.0和pH9.0下經(jīng)高壓微射流40MPa和80MPa處理后有顯著的增加，隨后隨著壓力的升高有下降的趨勢(shì)(圖2B)。Wang Xiansheng等[12]研究高壓對(duì)SPI的功能性質(zhì)的影響時(shí)則發(fā)現(xiàn)，樣品經(jīng)200～600MPa超高壓處理后，其ESI呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，與本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相吻合。這可能是由于在中性或堿性條件下，超過某一臨界壓力后，由于蛋白質(zhì)分子的聚集導(dǎo)致柔曲性降低。而柔曲性是影響乳化穩(wěn)定性的一個(gè)重要因素[13]。

此外，EAI對(duì)pH值具有依賴性。由圖2A可以看出，在pH5.0處(等電點(diǎn)附近)，EAI最低(16.9～26.7m2/g)，而在偏離等電區(qū)域EAI則迅速增加，在pH9.0處，其EAI可達(dá)46.7～66.4m2/g，這表明蛋白質(zhì)的乳化性與蛋白質(zhì)的溶解度呈正相關(guān)。

2.3 大豆分離蛋白表面疏水性和DSC變性參數(shù)

圖3 高壓微射流處理對(duì)大豆分離蛋白的表面疏水性影響Fig.3 Effect of HPM treatment on H0 of SPI

圖3為高壓微射流處理對(duì)大豆分離蛋白疏水性的影響。在較低壓力處理(0～80MPa)和較高壓力處理(80～160MPa)后，蛋白的表面疏水性與處理壓力均呈線性相關(guān)性。在高于80MPa處理的樣品，表面疏水性變化顯著，呈急速上升的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)樵?～80MPa范圍內(nèi)，蛋白分子逐漸展開，導(dǎo)致內(nèi)部疏水基團(tuán)部分外露，H0開始緩慢增加；而隨著壓力的增加，在80～160MPa范圍內(nèi)，蛋白分子展開得更加完全，導(dǎo)致H0急速上升。Molina等[14]采用超高壓手段研究7S球蛋白、11S球蛋白和SPI時(shí)，發(fā)現(xiàn)0.1～200MPa范圍內(nèi)，這3種蛋白的H0均呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)；Wang Xiansheng等[12]采用超高壓處理SPI時(shí)，得出了同樣的結(jié)果。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論是一致的。

圖4 典型的SPI熱變性DSC圖譜Fig.4 Typical DSC thermogram of SPI

由圖4可知，在75℃和90℃處有兩個(gè)峰，分別對(duì)應(yīng)著7S和11S球蛋白的變性溫度。SPI中的11S球蛋白在不同的壓力水平(0～160MPa)高壓微射流處理后具有相似的變性溫度(td)，表明SPI結(jié)構(gòu)比較緊湊[15-17]。變性焓變(ΔH)主要用來反映蛋白的變性程度[18]，隨著壓力的增加(0～160MPa)，SPI的變性焓變顯著下降(表1)，這表明不同壓力促使蛋白分子發(fā)生不同程度的展開進(jìn)而發(fā)生部分變性。Puppo[19]、Wang Xiansheng[12]等均發(fā)現(xiàn)SPI經(jīng)200～600MPa處理后，ΔH會(huì)顯著下降，甚至下降為0。這進(jìn)一步說明，壓力可以使蛋白分子展開甚至完全展開，從而導(dǎo)致蛋白部分變性或者完全變性。

表1 高壓微射流處理的大豆分離蛋白和對(duì)照蛋白的DSC參數(shù)Table 1 Thermal transition properties of native and HPM-treated SPIs

2.4 大豆分離蛋白圓二色譜(CD)光譜分析

圖5 大豆分離蛋白遠(yuǎn)紫外(A)和近紫外(B)圓二色光譜圖Fig.5 Far- and near-UV CD spectra of SPI

對(duì)照和高壓微射流處理樣品的遠(yuǎn)近紫外區(qū)域圓二色光譜如圖5A、B所示。圖5A表明，樣品在210～220nm處有一較寬的負(fù)峰，在196nm處存在一個(gè)明顯的正峰，這表明大豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-類結(jié)構(gòu)為主[20]。

近紫外區(qū)域圓二色光譜進(jìn)一步揭示了大豆分離蛋白三、四級(jí)構(gòu)象。在近紫外區(qū)域(250～320nm)，CD信號(hào)主要源于芳香族氨基酸，每種芳香族氨基酸有其特征的圖譜，色氨酸(Trp)的吸收峰主要在290nm，在290～305nm具有精細(xì)結(jié)構(gòu)；而酪氨酸(Tyr)的吸收峰在275～282nm之間；苯丙氨酸(Phe)殘基具有弱蛋白尖銳的峰，其精細(xì)結(jié)構(gòu)在255～270nm范圍[21]。蛋白近紫外區(qū)域CD光譜光譜圖形狀主要取決于蛋白中所含的芳香族氨基酸總類、流動(dòng)性以及其微環(huán)境(氫鍵，極性基團(tuán)和極化度)[21]。由圖5B可知，大豆分離蛋白的近紫外-CD光譜呈現(xiàn)出一個(gè)主要的正峰在275nm處，為酪氨酸的特征峰。在所施加的壓力(0～160MPa)范圍內(nèi)，高壓微射流處理后樣品遠(yuǎn)近紫外區(qū)域圓二色光譜相似，表明高壓微射流處理對(duì)大豆分離蛋白的二、三、四級(jí)構(gòu)象影響甚微。尹壽偉等[2]運(yùn)用高壓微射流處理蕓豆分離蛋白同樣發(fā)現(xiàn)，高壓微射流處理對(duì)蕓豆分離蛋白的二級(jí)構(gòu)象無顯著影響。

3 結(jié) 論

3.1 高壓微射流處理均能不同程度改善各pH值條件下SPI的溶解度，而且堿性條件下的提高程度高于酸性條件下。

3.2 高壓微射流處理顯著改善了SPI的EAI，而ESI則呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。SPI的EAI與其溶解度呈現(xiàn)正相關(guān)性。在pH5.0(等電點(diǎn)附近)，乳化活性指數(shù)最低，而偏離等電區(qū)域乳化活性指數(shù)迅速增加，在堿性條件下，大豆分離蛋白乳化活性指數(shù)高達(dá)66.4m2/g。

3.3 表面疏水性和DSC圖譜表明，0～160MPa高壓微射流處理可以使蛋白分子展開，使蛋白發(fā)生部分變性；圓二色光譜結(jié)果表明高壓微射流處理對(duì)于維系蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的次級(jí)相互作用力沒有明顯影響。

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Effect of High Pressure Microfluidization on Functional and Conformational Properties of SPI

SHEN Lan，WANG Chang-sheng，TANG Chuan-he*
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

The effect of high pressure microfluidization (HPM) on functional properties and conformational properties of soy protein isolated(SPI) was investigated by measuring solubility, emulsification, hydrophobic properties, DSC thermogram and UV-CD spectrum. HPM could cause insoluble aggregates to dissociate, thus improving the solubility, emulsifying activity index(EAI) and hydrophobic properties of SPI. DSC analysis indicatedTd remained basically unchanged, but ΔHtended to decline.UV-CD spectrum analysis showed that both the tertiary conformation and secondary structure of SPI were nearly unaffected by HPM treatment.

soy protein isolated (SPI)；high pressure microfluidization；functional properties；conformation

TS201.2

A

1002-6630(2012)03-0072-05

2011-03-02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30972049)

沈蘭(1986—)，女，碩士研究生，主要從事植物蛋白研究。E-mail：slflesy@126.com

*通信作者：唐傳核(1973—)，男，副教授，博士，主要從事植物蛋白研究。E-mail：chtang@scut.edu.cn