荸薺皮多酚的提取及脂質(zhì)抗氧化活性

郭艷華，李艾華，張玉敏

（江漢大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430056）

酚類(lèi)是天然化合物中的一個(gè)大類(lèi)，廣泛存在于不同結(jié)構(gòu)、不同種類(lèi)的植物中，其中一些酚類(lèi)化合物是眾所周知的抗氧化劑。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，一些農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)副產(chǎn)品（如茶葉、花生殼、柑橘類(lèi)果皮、果汁殘?jiān)龋┑奶崛∥镏幸埠胸S富的多酚類(lèi)物質(zhì)，其中有些提取物中多酚含量很高。因此來(lái)自農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)副產(chǎn)品的植物多酚將成為保健食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)的重點(diǎn)開(kāi)發(fā)研究對(duì)象［1-3］。至今，對(duì)荸薺的加工副產(chǎn)品荸薺皮中多酚的研究未見(jiàn)報(bào)道。本文研究超聲優(yōu)化荸薺皮多酚的提取工藝，并研究其粗提物的脂質(zhì)抗氧化作用，為天然生物廢棄資源的深度開(kāi)發(fā)和利用提供科學(xué)信息。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料和試劑 原料：荸薺皮（收集于武漢市鄂城墩集貿(mào)市場(chǎng)）。

試劑：焦性沒(méi)食子酸、茶多酚、β-胡蘿卜素等為生化試劑；無(wú)水乙醇、MnO4、FeCl3、溴水、硫代巴比妥酸（TBA）、NaOH（固體）、濃鹽酸、石油醚、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）、Tween-40、亞油酸等均為分析純。

1.1.2 主要儀器 721分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV—2401紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；RE—52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；ST-02A多功能粉碎機(jī)，永鑫市帥通工具有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，鞏義市予華儀器有限公司；DFll0型電子分析天平，中國(guó)輕工業(yè)機(jī)械總公司常熟衡器公司；KQ-250型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 荸薺皮多酚的提取方法 將荸薺皮破碎，過(guò)60目篩，粉碎后加入約10倍體積的石油醚浸提12 h脫脂，室溫下干燥至恒質(zhì)量。以提取多酚含量作為指標(biāo)，進(jìn)行初步的單因素實(shí)驗(yàn)。在單因素提取實(shí)驗(yàn)中，超聲波輔助提取時(shí)間為50 min時(shí)多酚含量最為突出，故提取時(shí)間單因素不必作為正交因素水平，在單因素實(shí)驗(yàn)中即可確定提取時(shí)間為50 min。綜合考慮其它單因素水平乙醇濃度、液料比和提取液的酸度，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表（見(jiàn)表1），以確定最佳提取條件。單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果：提取劑酸度pH為3.5，提取劑乙醇濃度為60%，料液比為1∶20（g∶mL）。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)最佳條件提取荸薺皮多酚，過(guò)濾后減壓濃縮至膏狀，根據(jù)測(cè)定的需求濃度用要求的溶劑定容，即為荸薺皮多酚提取物。

1.2.2 酚類(lèi)物質(zhì)的顯色鑒定 取少量荸薺皮的提取液，分別加入 ① 溴水、② KMnO4溶液、③FeCl3溶液，進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 紫外-可見(jiàn)光譜的測(cè)定 稱(chēng)取1.00 g荸薺皮粉于錐形瓶中，根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)最佳條件取荸薺皮多酚提取物1 mL于比色管中，用50%乙醇稀釋至刻度，用1 cm的比色皿測(cè)其紫外吸收光譜，結(jié)果如圖1所示。

圖1 荸薺皮提取液的吸收光譜

1.2.4 多酚含量的測(cè)定 （1）沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制。利用沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和Folin試劑等測(cè)定并制作沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)［4］。以吸光度 A為橫坐標(biāo)，總酚濃度C（mg/mL）為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，回歸方程：C=7.9234A-0.0157，相關(guān)系數(shù) R=0.9999。（2）荸薺皮多酚提取物中總酚含量的測(cè)定。以提取液代替沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方法測(cè)定提取物中的總酚含量。

1.2.5 荸薺皮多酚提取物脂質(zhì)抗氧化活性的測(cè)定

（1）對(duì)亞油酸/β-胡蘿卜素實(shí)驗(yàn)。采用β-胡蘿卜素褪色實(shí)驗(yàn)測(cè)定荸薺皮提取物抗油脂氧化能力［5］。以1.0 mL 氯仿溶解0.5 mg β-胡蘿卜素，加入200 mg Tween-40和25 μL亞油酸，均勻混合后蒸干。加入100 mL蒸餾水，振蕩均勻。取4 mL上述混合液，加入200 μL提取物樣品溶液，于50℃加熱3 h。以常用抗氧化劑BHT和茶多酚作對(duì)照實(shí)驗(yàn)。測(cè)定反應(yīng)前后樣品在波長(zhǎng)490 nm處的吸光度。抗氧化能力按下式進(jìn)行計(jì)算：

式中：A0，A0′分別為初始樣品和對(duì)照組的吸光度；At，At′分別為3 h后樣品和對(duì)照組的吸光度。抑制率越大，對(duì)亞油酸脂質(zhì)氧化的抑制作用越強(qiáng)。

（2）對(duì)Fe2+催化亞油酸脂質(zhì)過(guò)氧化體系的抗氧化作用測(cè)定。在pH=7.4的10 mL 0.2 mol/L的磷酸鈉緩沖液中，加入2.5%的亞油酸乙醇液4.2 mL，蒸餾水4.8 mL，再加入Fe2+（［Fe2+］=2.54 ×10-3g/L）溶液1 mL，使Fe2+催化亞油酸形成底物溶液。加入底物質(zhì)量濃度為0.05%、0.10%和0.15%的荸薺皮乙醇提取物、茶多酚和BHT，混合后在40℃的生化培養(yǎng)箱中反應(yīng)16 h，取出，迅速加入25%的三氯乙酸混勻。然后加入0.67%的TBA，在沸水浴中加熱15 min。取出冷卻，加入4 mL正丁醇，混勻，離心15 min，取正丁醇液于532 nm比色，同時(shí)測(cè)定不加抗氧化物的吸光度。

研究表明：亞油酸氧化的起始反應(yīng)很慢，但微量的過(guò)渡金屬離子可起催化作用。當(dāng)向亞油酸中加入Fe2+時(shí)，除了可以加速起始反應(yīng)外，還可與脂質(zhì)過(guò)氧化的中間產(chǎn)物脂質(zhì)過(guò)氧化物（LOOH）反應(yīng)，使其分解產(chǎn)生烷氧基（LO·）和脂質(zhì)過(guò)氧自由基（LOO·），從而加速脂質(zhì)氧化反應(yīng)的進(jìn)行。亞油酸的氧化產(chǎn)物過(guò)氧化物可分解產(chǎn)生二級(jí)產(chǎn)物丙二醛，丙二醛與硫代巴比妥酸作用生成有色染料，最大吸收波長(zhǎng)為532 nm。由吸光值的大小可判斷丙二醛產(chǎn)生的多少，并評(píng)估各樣品在催化條件下的抗氧化效果。抗氧化樣品加入可清除自由基，抑制丙二醛的產(chǎn)生，吸光度越小，抗氧化活性越強(qiáng)。清除率計(jì)算公式如下：

清除率/%=［(A0-At)/(A0)］×100%，

其中：A0為不加樣品的吸光度值，At為加樣品后的吸光度值。

（3）對(duì)Fenton反應(yīng)催化亞油酸脂質(zhì)過(guò)氧化體系的抗氧化作用測(cè)定。在pH=7.4的10 mL 0.2 mol/L的磷酸鈉緩沖液中，加入2.5%的亞油酸乙醇液4 mL，蒸餾水4.4 mL，再加入Fe2+（［Fe2+］=2.54×10-3g/L）溶液1 mL和0.5 mL 0.01%的H2O2催化亞油酸形成底物溶液。其余方法同1.2.5的方法（2）。

1.2.6 荸薺皮多酚提取物脂質(zhì)抗氧化活性與多酚含量的關(guān)系測(cè)定 將超聲輔助法最佳提取物溶液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，配制系列荸薺皮多酚含量不同的溶液，然后測(cè)定對(duì)亞油酸/β-胡蘿卜素實(shí)驗(yàn)的抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波法提取荸薺皮多酚的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

超聲波法提取荸薺皮多酚的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可以看出，在3個(gè)因子中，以提取劑濃度對(duì)提取率的影響最大；各因子對(duì)提取率的影響依次為提取劑濃度、提取劑酸度、料液比。確定最佳工藝條件為60%乙醇，提取劑酸度pH=3.5，料液比為1∶30（g/mL），提取時(shí)間為單因素實(shí)驗(yàn)確定的50 min，此條件提取的多酚得率1.8%。查得 F0.05（2，2）=19.00，F(xiàn)0.01（2，2）=99.00，由表3可知，3種影響因素均為不顯著性影響因子。

表2 L933正交表和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

2.2 荸薺皮多酚的顯色反應(yīng)結(jié)果

按照1.2.2的方法進(jìn)行試驗(yàn)，得到酚類(lèi)物質(zhì)定性初步鑒定結(jié)果（表4）。根據(jù)酚類(lèi)物質(zhì)的顯色反應(yīng)特征，說(shuō)明荸薺皮提取物中含酚類(lèi)物質(zhì)［7-8］。

表4 酚類(lèi)物質(zhì)顯色反應(yīng)結(jié)果

2.3 紫外—可見(jiàn)吸收光譜的測(cè)定

按1.2.3實(shí)驗(yàn)方法測(cè)得荸薺皮多酚粗提液紫外—可見(jiàn)吸收光譜見(jiàn)圖1。

荸薺皮粗提液的吸收光譜中有3個(gè)吸收峰，峰Ⅰ為303.00 nm，峰Ⅱ?yàn)?86.50 nm，峰Ⅲ為205.00 nm，而在可見(jiàn)區(qū)無(wú)明顯吸收，這正是植物中多酚類(lèi)物質(zhì)的吸收光譜特征［9］。

2.4 荸薺皮多酚提取物脂質(zhì)抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.4.1 對(duì)亞油酸/β-胡蘿卜素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由圖2得知，在亞油酸/β-胡蘿卜素自氧化體系中，荸薺皮多酚提取物、茶多酚、BHT均有明顯的抑制作用，荸薺皮多酚提取物和茶多酚抑制能力相當(dāng)，但不如BHT。在10～80 mg/L濃度范圍內(nèi)，三者的抑制能力明顯增大，而當(dāng)濃度為100～300 mg/L濃度范圍內(nèi)，抑制作用緩慢增大。

圖2 荸薺皮提取物對(duì)亞油酸/β-胡蘿卜素自氧化體系的抑制作用

2.4.2 對(duì)Fe2+催化亞油酸脂質(zhì)過(guò)氧化體系的抗氧化作用的測(cè)定結(jié)果 由表5可知，荸薺皮提取物對(duì)催化條件下亞油酸的脂質(zhì)過(guò)氧化物有抗氧化作用，且隨提取物濃度的增強(qiáng)抗氧化性增強(qiáng)，荸薺皮提取物的抗氧化作用強(qiáng)于同濃度的天然抗氧化劑茶多酚，但不及同濃度的合成抗氧化劑BHT。

表5 荸薺皮提取物在Fe2+催化條件下的抗氧化作用/%

圖3 荸薺皮提取物的脂質(zhì)抗氧化活性與多酚含量的關(guān)系

2.4.3 對(duì)Fenton反應(yīng)催化亞油酸脂質(zhì)過(guò)氧化體系的抗氧化作用的測(cè)定結(jié)果 此反應(yīng)體系中，F(xiàn)e2+除了催化起始反應(yīng)，與過(guò)氧化物形成LO·LOO·自由基外，還可以與H202反應(yīng)，產(chǎn)生高活性的氫氧自由基·OH，加速氧化反應(yīng)的進(jìn)行。提取物對(duì)Fenton反應(yīng)催化下脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用結(jié)果見(jiàn)表6?？梢?jiàn)荸薺皮提取物對(duì)該體系也有一定的抗氧化作用，與茶多酚的能力接近。多酚的特征，初步可判斷荸薺皮提取物中含有多酚類(lèi)物質(zhì)。

3）荸薺皮多酚提取物具有較強(qiáng)的脂質(zhì)抗氧化活性，在對(duì)亞油酸的不同體系中，抗氧化能力強(qiáng)于或接近于茶多酚，弱于合成的抗氧化劑BHT。

4）荸薺皮是食品加工廢棄生物資源，研究說(shuō)明其中含有較強(qiáng)的抗氧化性物質(zhì)，是值得開(kāi)發(fā)利用的新資源。

表6 荸薺皮提取物在Fenton反應(yīng)催化條件下的抗氧化作用/%

2.5 荸薺皮多酚提取物脂質(zhì)抗氧化活性與多酚含量的關(guān)系測(cè)定

按1.2.6實(shí)驗(yàn)測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明：荸薺皮提取物的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力與其提取物中多酚含量有一定關(guān)聯(lián)性，但并未呈完全關(guān)聯(lián)性，說(shuō)明其中還有其它種類(lèi)的物質(zhì)具有抗氧化作用，有待于今后進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

1）超聲輔助提取荸薺皮中多酚的最佳條件是：提取劑乙醇濃度為60%，提取劑酸度pH=3.5，料液比為1∶30（g/mL），提取時(shí)間為50 min。

2）經(jīng)顯色反應(yīng)和紫外可見(jiàn)吸收光譜的測(cè)定，荸薺皮提取物顯色反應(yīng)和紫外可見(jiàn)吸收光譜具有

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