羅險峰,劉 建,湯德元,李春燕
( 1.貴州省動物疫病預防控制中心,貴州 貴陽 550008;2.貴州大學動物科學學院,貴州 貴陽 550025)
豬 瘟(classic swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起的豬的—種急性、熱性和高度接觸傳染的病毒性傳染病。該病的臨床特征為發(fā)病豬高熱稽留、細小血管壁變性導致引起各器官組織的廣泛出血、脾梗死等[1-2]。CSF具有高度接觸傳染性,流行范圍廣,發(fā)病率和死亡率極高,給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[3]。CSF被OIE列為A類傳染病,我國也將其列為一類動物傳染病。2012 年3月,貴州省某豬場共有存欄豬80頭,發(fā)病3 d共計死亡10頭。為了掌握該豬場疫病的感染狀況,對該豬場送檢的病料進行流行病學調(diào)查、臨床癥狀觀察、解剖病理診斷、細菌學檢測和RT-PCR技術(shù)診斷,最終確診為豬瘟病毒感染?,F(xiàn)將診斷結(jié)果報道如下。
病料:貴州省某豬場送檢的發(fā)病豬血清10份,發(fā)病豬1頭。
鮮血瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、瓊脂糖(均購自上海陽光生物技術(shù)有限公司);豬瘟抗體金標檢測卡(購自深圳市康百得生物科技有限公司);豬瘟病毒RT-PCR檢測試劑盒(購自北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司); DL 2000 DNA Marker(購自大連寶生物工程有限公司)。
1.3.1 流行病學調(diào)查 采用向畜主詢問的方法,了解豬場發(fā)病狀況并記錄。
1.3.2 臨床癥狀及剖檢病理變化對該豬場送檢的發(fā)病豬進行臨床觀察及剖檢病理變化觀察,并記錄實驗結(jié)果。
1.3.3 快速金標檢測卡檢測血清樣本 應(yīng)用豬瘟病毒抗體快速金標檢測卡對送檢10份血清進行檢測,嚴格按照檢測試劑盒說明書進行操作。
1.3.4 細菌分離 剖檢送檢病豬后,無菌采集病變明顯的腎臟、肺臟、淋巴結(jié)和脾臟等組織器官,進行直接觸片,分別進行革蘭氏和瑞氏染色,鏡檢。同時將上述病料、關(guān)節(jié)積液和心血等無菌操作劃線接種在普通瓊脂平板培養(yǎng)基和鮮血瓊脂培養(yǎng)基上,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h觀察。
1.3.5 RT-PCR檢測 按照豬瘟病毒RT-PCR檢測試劑盒說明書處理上述收集的淋巴結(jié)、腎臟、脾臟、肺臟和肝臟等病料,然后提取病毒總RNA,進行RT-PCR擴增。RT-PCR反應(yīng)體系:16.8μL RT-PCR反應(yīng)液(用前混勻),1.2μL酶混合液,2μL模板RNA,總體積20μL。RT-PCR反應(yīng)條件:42 ℃ 45 min,95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 25 s,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。
該豬場共有存欄豬80頭,發(fā)病3天共計死亡10頭。發(fā)病豬出現(xiàn)了體表發(fā)紅,發(fā)熱、體溫升高到40.0~41.0 ℃、稽留不退,衰弱顫抖,病豬先便秘后腹瀉。體溫開始升高時可見病豬便秘,先排出干燥糞球呈顆粒狀,后排出帶白色黏液、黏膜或膿血的深褐色糞球等疑似豬瘟癥狀。
臨床癥狀:送檢病豬被毛粗亂,消瘦,尾根和肛門附近被糞便污染,體溫升高(41 ℃左右),眼角有膿性分泌物,精神抑郁,眼瞼水腫,兩眼有多量黏膿性分泌物,咳嗽、嘔吐、流涎,全身皮膚有明顯出血點、出血斑。
剖檢病理變化:心包液增多、心肌柔軟,腎臟、膀胱、脾臟、喉頭、會厭軟骨、膽囊、胃和大腸黏膜出血;脾臟明顯腫大,邊緣或尖端有出血性梗死灶;肝臟邊緣鈍厚、質(zhì)硬、切面結(jié)構(gòu)模糊;頜下、腸系膜及腹股溝等處淋巴結(jié)腫脹,充血或出血,外表顏色從深紅色到紫紅色,切面呈紅白相間的大理石樣。
應(yīng)用豬瘟抗體快速金標檢測卡對送檢的10份發(fā)病豬血清進行檢測。結(jié)果10份送檢血清在檢測線區(qū)(T)及對照線區(qū)(C)同時出現(xiàn)了紫紅色線(圖1),而且檢測線區(qū)(T)顏色較深,這表明豬體內(nèi)的豬瘟抗體滴度很高。
將肝、肺、脾、腎、淋巴結(jié)等組織觸片,進行革蘭氏和瑞氏染色后,在光鏡下未見有特征性的細菌生長,普通瓊脂培養(yǎng)基和鮮血瓊脂培養(yǎng)基上也沒有觀察到細菌生長,這表明該病例并非細菌感染所致。
剖檢送檢病豬取其淋巴結(jié)、肝臟、腎臟、脾臟和扁桃體等病變組織20 g,按病料與PBS液體積比1∶5加入PBS研磨制成懸液,然后按照豬瘟RT-PCR檢測試劑盒說明書提取病毒總RNA,進行RT-PCR擴增,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)了CSFV陽性條帶,大小為272 bp,與CSFV陽性對照條帶一致,這說明送檢的病料中存在CSFV。結(jié)果見圖2。
1)通過流行病學調(diào)查、臨床癥狀觀察、剖檢病理診斷及豬瘟抗體快速金標檢測卡檢測,初步診斷該豬場斷奶仔豬疑似豬瘟病毒感染。通過對發(fā)病豬的淋巴結(jié)、腎臟、脾臟、肺臟和肝臟等組織進行細菌檢測,結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)細菌感染的存在。RT-PCR結(jié)果顯示,送檢病豬中檢出了CSFV核酸陽性條帶,表明該豬場已經(jīng)感染了CSFV野毒。
2)近年來豬場的疾病情況日趨復雜,病毒性疫病的雙重感染、三重感染、細菌和多重病毒感染的現(xiàn)象越來越普遍,豬場的發(fā)病死亡率越來越高[4]。本次檢測結(jié)果表明,該豬場僅為豬瘟病毒單一感染。因此,建議該豬場緊急接種豬瘟病毒疫苗,將可疑豬和病豬全部隔離飼養(yǎng),病死豬及污染物則徹底焚燒或深埋,對污染的圈舍和四周環(huán)境進行嚴格消毒,患病豬群則帶豬消毒,同時加強飼養(yǎng)管理并合理投喂抗生素避免其他疫病的繼發(fā)感染。
3)抗體快速金標檢測卡和PCR方法在豬場疫病檢測中的聯(lián)合應(yīng)用,不僅實現(xiàn)了血清學抗體檢測,同時根據(jù)血清學抗體檢測結(jié)果,再進行PCR檢測,避免了對病原的盲目判斷,從而實現(xiàn)對疫病感染狀況的快速診斷。
[1]殷震,劉景華.動物病毒學[M].2版.北京:科學出版社,1997:652-664.
[2]蔡寶祥.家畜傳染病學[M].4版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2001:201-206.
[3]Edwards S, Fukusho A, Lefevre P C, et al. Classical swine fever: the global situation[J].Vet Microbiol,2000,13(73):103-119.
[4]梁大明,陸紅梅,高婕,等.淺析我國豬病流行現(xiàn)狀及應(yīng)對策略[J].中國畜牧獸醫(yī),2007,34(1):160-161.