吳周睿，胡 笑，徐 委，孫曉晴，管曉菲，程黎明

同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院脊柱外科，上海 200065

骨科手術(shù)中需要使用大量自體骨和/或異體骨進(jìn)行組織填充。然而目前骨質(zhì)資源匱乏，而且異體骨可能存在免疫排斥反應(yīng)，對(duì)骨折愈合產(chǎn)生十分不利的影響。近五年來(lái)再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中干細(xì)胞技術(shù)的廣泛應(yīng)用為治療眾多人類(lèi)疾病帶來(lái)革命性突破。目前已經(jīng)出現(xiàn)了許多干細(xì)胞治療各種人類(lèi)疾病的研究報(bào)道錯(cuò)誤!未找到引用源。。同樣，通過(guò)干細(xì)胞技術(shù)，理論上也能獲得大量患者自體或異體的骨質(zhì)。并且將取自患者自身的細(xì)胞培養(yǎng)、分化成適合進(jìn)行移植的骨質(zhì)，能夠避免排斥反應(yīng)，提高質(zhì)量效果和患者預(yù)后生活質(zhì)量。由于各種來(lái)源的干細(xì)胞形成骨質(zhì)的能力不同，與成骨母細(xì)胞來(lái)自同一發(fā)育起源的間質(zhì)干細(xì)胞成為首選種子細(xì)胞;而臍帶血間質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源充足，取材簡(jiǎn)便，成為最佳候選細(xì)胞。

但是目前干細(xì)胞成骨分化效率較低，其中具體分化機(jī)制也尚不明確。有證據(jù)表明DNMT3B在人胚胎期和出生后成骨分化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。另外在人類(lèi)遺傳病ICF綜合癥中發(fā)現(xiàn)，DNMT3B突變可能會(huì)引起患者頜面部骨骼發(fā)育畸形，這些研究表明DNMT3B在成骨分化過(guò)程中十分重要錯(cuò)誤!未找到引用源。。

為了進(jìn)一步提高干細(xì)胞成骨分化的效率，明確DNMT3B與細(xì)胞成骨分化作用之間的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)嘗試建立帶有DNMT3B基因沉默的人臍帶血間質(zhì)干細(xì)胞，并通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)、分化技術(shù)，分子學(xué)基因表達(dá)水平檢測(cè)和DNA甲基化水平檢測(cè)技術(shù)等，評(píng)價(jià)DNMT3B缺失后對(duì)人臍帶血間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化造成的影響。

1 材料與方法

1.1 hUMSCs培養(yǎng)及鑒定

實(shí)驗(yàn)中使用臍帶血間質(zhì)干細(xì)胞購(gòu)自與Sciencell公司(貨號(hào)#7530)。將1×106的hUMSCs培養(yǎng)在T25培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為低糖 DMEM，5%胎牛血清，10 ng/ml血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，10 ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，隔日換液。并通過(guò)使用表面標(biāo)志物CD44和CD90抗體對(duì)hUMSCs進(jìn)行免疫組織化學(xué)鑒定。

1.2 DNMT3B突變型hUMSCs建立

設(shè)計(jì)DNMT3B RNA特異性干擾靶點(diǎn)位于人DNMT3B cDNA 3＇UTR區(qū)，其結(jié)合特異性經(jīng)過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù) blast對(duì)比確認(rèn)。在設(shè)計(jì)的21 bp siRNA序列中未發(fā)現(xiàn)明顯的人同源性序列。siRNA正義鏈序列為5＇-AACTGGAGCCACGACGTAACA-3＇，反 義 鏈 序 列 為 5＇-AACTGGAGCCACGACGTAACA-3＇。將此雙鏈置于1×siRNA退火緩沖液(6 mM HEPES(pH 7.4)，20 mM KCl和 0.4 mM Mg(OAC)2)中以90℃退火1分鐘后，置于37℃中培育1小時(shí)形成雙鏈。siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)，將27 μg siRNA表達(dá)載體輕柔加入至 4.5 ml含有 45 μL Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑的Opti-MEM?轉(zhuǎn)染液中，室溫靜止孵育5分鐘。孵育完成后將含有質(zhì)粒和Lipo2000的Opti-MEM?轉(zhuǎn)染液加入至5×105hUMSCs中。37℃孵育過(guò)夜。感染第4天通過(guò)免疫組化染色和qPCR法檢查細(xì)胞感染效率。

1.3 成骨分化實(shí)驗(yàn)

將hUMSCs種植于載玻片上，加入成骨細(xì)胞培養(yǎng)液中誘導(dǎo)分化2周，即可獲得Osteocalcin陽(yáng)性的成骨細(xì)胞，隨后進(jìn)行礦化功能染色鑒定。成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化液配方:DMEM+10%胎牛血清+L-抗壞血酸 100，β-甘油磷酸酯 10 mM，地塞米松 10 nM，非必需氨基酸5 ml，谷氨酰胺5 ml，雙抗5 ml。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件完成。實(shí)驗(yàn)資料用±s表示組間兩兩比較，采用單因素方差分析，當(dāng)P＜0.05和P＜0.01時(shí)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 DNMT3B突變型hUMSCs建立

野生型hUMSCs購(gòu)得后，按照該公司培養(yǎng)要求進(jìn)行一定比例的擴(kuò)增后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。獲得的細(xì)胞形態(tài)上具有間質(zhì)干細(xì)胞特征(圖1)。

圖1 野生型hUMSCs培養(yǎng)形態(tài)Fig.1 The morphology of hUMSCs

DNMT3B siRNA轉(zhuǎn)染hUMSCs后，免疫組織化學(xué)染色和qPCR法檢測(cè)內(nèi)源性DNMT3B表達(dá)水平。結(jié)果顯示獲得兩株DNMT3B突變型細(xì)胞(shD3B-1和shD3B-2)轉(zhuǎn)染效率約95%，兩株突變型hUMSCs中DNMT3B表達(dá)量分別下降至野生型hUMSCs的12.67 ±0.45%和35.60 ±0.76%(P ＜0.05，圖2)。

與野生型 hUMSCs相比，雖然這種兩株DNMT3B突變型hUMSCs也能夠表達(dá)特異性標(biāo)記物CD44和CD90(圖3)，但是特異性標(biāo)記物CD90和CD73 mRNA表達(dá)水平下降，shD3B-1和shD3B-2的 CD73水平是正常細(xì)胞的15.83±0.44%和16.60±0.37%(P ＜0.05);而 CD90 的水平是正常細(xì)胞的 35.23 ±0.30% 和 58.64 ±0.71%(P＜0.05)(圖4)。

圖2 RNA干擾后DNMT3B mRNA表達(dá)水平Fig.2 The expression level of DNTM3B after RNA interference

圖3 免疫組化染色顯示CD44和CD90表達(dá)水平Fig.3 The CD44 and CD90 expression were showed by immunostaining

2.2 DNMT3B突變型hUMSCs成骨細(xì)胞分化

圖4 qPCR結(jié)果顯示CD73和CD90 mRNA表達(dá)水平Fig.4 The CD73 and CD90 expression were showed by qPCR

成骨細(xì)胞分化兩周后，免疫組化染色顯示突變型和野生型hUMSCs細(xì)胞均能被誘導(dǎo)為表達(dá)Osteocalcin的成骨母細(xì)胞，但是DNMT3B突變型細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度比野生型細(xì)胞明顯較弱，而且成骨區(qū)域形態(tài)也不及野生型成熟(圖5)。

圖5 免疫組化染色顯示Osteocalcin在成骨細(xì)胞中表達(dá)水平Fig.5 The osteocalcin expression were showed by immunostaining

qPCR顯示三個(gè)與成骨直接相關(guān)的基因——RUNX2，IBSP和 ALPL在誘導(dǎo)分化兩周后的DNTM3B突變型hUMSCs中表達(dá)顯著低于野生型hUMSCs(圖 6)。其中 shD3B-1和 shD3B-2的RUNX2基因表達(dá)水平分別為正常細(xì)胞的55.09±0.53%和 53.77 ±0.47%;IBSP 基因表達(dá)水平分別為正常細(xì)胞的 53.21 ±0.81% 和 41.75 ±0.44%;ALPL基因表達(dá)水平分別為正常細(xì)胞的15.55±0.10%和 17.86 ±24%(P ＜0.01)。

進(jìn)一步對(duì)成骨母細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色(Alizarin Red Staining，ARS)檢測(cè)成骨后細(xì)胞功能。染色結(jié)果顯示DNMT3B突變型hUMSCs成骨功能低于野生型hUMSCs(圖7)。

圖6 qPCR結(jié)果顯示成骨相關(guān)基因在成骨細(xì)胞中的表達(dá)情況Fig.6 The RUNX2，IBSP and ALPL expression were showed by qPCR

圖7 礦化染色顯示成骨分化后細(xì)胞功能Fig.7 The function of osteogenesis was tested by alizarin red staining

3 討論與結(jié)論

為了進(jìn)一步研究DNMT3B基因與間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制hUMSCs中內(nèi)源性DNMT3B表達(dá)，隨后進(jìn)行終端成骨母細(xì)胞分化工作。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):兩株DNMT3B突變型hUMSCs和野生型hUMSCs均能被誘導(dǎo)為表達(dá)Osteocalcin蛋白的成骨細(xì)胞，但是DNMT3B突變型hUMSCs來(lái)源的成骨細(xì)胞中成骨相關(guān)基因的表達(dá)(RUNX2，IBSP和 ALPL)比野生型成骨細(xì)胞低。而且免疫組織化學(xué)結(jié)果也證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)。在進(jìn)行成骨母細(xì)胞功能性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)DNMT3B突變型hUMSCs礦化染色活性都比野生型要低。這些結(jié)果認(rèn)為DNMT3B突變或缺失會(huì)導(dǎo)致hUMSCs成骨分化能力下降。

DNMTs介導(dǎo)的DNA甲基化在高等哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用錯(cuò)誤!未找到引用源。。同樣在成骨系統(tǒng)發(fā)育階段，DNMTs，尤其是de novo DNMTs介導(dǎo)的DNA甲基化也參與其中。作為DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶家族中重要的一員，DNMT3B在細(xì)胞中發(fā)揮了DNA新建型甲基化的作用。因此DNMT3B突變首先產(chǎn)生的影響是DNA甲基化的丟失。通常來(lái)講，DNA甲基化調(diào)控基因表達(dá)的主要機(jī)制分為三步:首先待轉(zhuǎn)錄基因啟動(dòng)子區(qū)上CpG二核苷酸的甲基化會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄起始錯(cuò)誤!未找到引用源;其次DNA甲基化還能通過(guò)胞嘧啶上的甲基基團(tuán)與CpG甲基基團(tuán)結(jié)合蛋白(methyl-CpG binding proteins，MBDs)，進(jìn)一步從空間位置上阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合。;另外MBD蛋白能促進(jìn)組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶(Histone deacetylase，HDACs)在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)募集，改變組蛋白的構(gòu)象，進(jìn)一步抑制基因轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤!未找到引用源。因此在DNMT3B表達(dá)狀態(tài)缺失情況下，hUMSCs中多能性基因的抑制狀態(tài)可能被解除，相反成骨相關(guān)基因表達(dá)被抑制。

值得一提的是，在成骨發(fā)育的過(guò)程中，成骨基因的表達(dá)是時(shí)序性調(diào)控的過(guò)程，首先RUNX2在分化初始階段(誘導(dǎo)開(kāi)始4天以?xún)?nèi))具有轉(zhuǎn)錄起始的作用，因此其表達(dá)最早出現(xiàn);ALPL作為普遍常見(jiàn)的骨形成基因在分化的中期(誘導(dǎo)后1周左右)出現(xiàn)峰值;而作為影響成骨成熟形態(tài)及功能的基因，Osteocalcin一般出現(xiàn)在誘導(dǎo)后2～3周時(shí)。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)DNMT3B的缺失對(duì)同一時(shí)間點(diǎn)上三個(gè)不同階段的基因表達(dá)都具有抑制作用，因此不難推斷DNMT3B抑制成骨分化的靶點(diǎn)位于hUMSCs中，而不是成骨分化后期;同時(shí)由于DNMT3B主要存在于多潛能細(xì)胞中，在隨著終端分化的進(jìn)行DNMT3B表達(dá)水平逐漸下降。另外CD73和CD90的mRNA水平從另一個(gè)方面佐證了DNMT3B缺失對(duì)hUMSCs自身的抑制作用。這三個(gè)證據(jù)都共同指出，DNMT3B對(duì)于hUMSCs的成骨分化具有重要的調(diào)控作用。在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中對(duì)于成骨基因時(shí)序性表達(dá)的檢測(cè)可以更詳細(xì)的解釋DNMT3B對(duì)于成骨分化產(chǎn)生的影響。

另外，以免疫球蛋白水平低下，中心粒異染色質(zhì)區(qū)解凝和面部畸形為主要臨床表現(xiàn)的ICF(Immunodeficiency，Centromere instability and Facial abnormal)綜合征，已經(jīng)明確了DNMT3B基因突變是其主要遺傳學(xué)病因錯(cuò)誤!未找到引用源。。由此可以認(rèn)為，DNMT3B與人類(lèi)骨質(zhì)結(jié)構(gòu)形成相關(guān)。目前還沒(méi)有證據(jù)表明使用DNMT3B重表達(dá)技術(shù)能夠逆轉(zhuǎn)成骨異常，但是在間質(zhì)干細(xì)胞體系中，將來(lái)可以通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)將DNMT3B過(guò)表達(dá)后評(píng)價(jià)其成骨狀態(tài)。而且新興的成體細(xì)胞重編程技術(shù)(reprogramming)能夠在體外完整的模擬ICF綜合征的發(fā)病過(guò)程，進(jìn)一步明確DNMT3B在成骨細(xì)胞分化和骨質(zhì)形成中的具體作用機(jī)制。

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