一株芒果炭疽病拮抗菌抑菌活性的研究及其鑒定

李春玲，王慶國(guó)，*，胥麗娜，陳慶敏

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018；2.山東省果蔬食用安全工程技術(shù)研究中心，山東濟(jì)南 251400）

一株芒果炭疽病拮抗菌抑菌活性的研究及其鑒定

李春玲1，王慶國(guó)1，*，胥麗娜2，陳慶敏2

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018；2.山東省果蔬食用安全工程技術(shù)研究中心，山東濟(jì)南 251400）

從芒果表皮分離得到29株內(nèi)生細(xì)菌，對(duì)峙培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)菌株B2-1對(duì)芒果炭疽病菌絲的生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用。通過(guò)離體實(shí)驗(yàn)和活體實(shí)驗(yàn)對(duì)拮抗菌株B2-1抑菌活性進(jìn)行了研究，離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，B2-1的發(fā)酵濾液、揮發(fā)性代謝產(chǎn)物以及非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物都對(duì)芒果炭疽病菌絲的生長(zhǎng)有很強(qiáng)的抑制作用，其中B2-1發(fā)酵液的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)芒果炭疽病菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)到了99.86%，抑菌效果顯著?；铙w實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，B2-1的菌懸液和發(fā)酵液與對(duì)照相比顯著降低了芒果炭疽病的發(fā)病率，提高了芒果的可食用果率。進(jìn)一步對(duì)菌株B2-1進(jìn)行鑒定，綜合形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特征檢測(cè)以及16S rDNA序列分析，B2-1菌株被鑒定為枯草芽孢桿菌。

芒果，拮抗菌株B2-1，炭疽病，抑菌活性，鑒定

芒果是著名的熱帶水果，被譽(yù)為“熱帶水果之王”，在熱帶水果中排名第三。芒果果實(shí)因具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而備受國(guó)內(nèi)外特別是東方國(guó)家消費(fèi)者的歡迎[1]。炭疽病由膠孢炭疽菌引起[2]，是采后芒果的主要病害[3-4]，在世界各芒果產(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生[5]，其致病菌為黑盤孢科膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz）。該菌以分生孢子侵染植物的葉、梢、花穗、果，導(dǎo)致梢枯、葉斑、落葉和落花、落果。炭疽病菌于采前在田間潛伏侵染芒果，采后很難控制，因而易導(dǎo)致貯運(yùn)期間果實(shí)腐爛，縮短芒果的商品貨架期[6]。目前主要依靠化學(xué)殺菌的方法來(lái)抑制芒果炭疽病害，也有利用植物提取物防治芒果炭疽病[7-8]。但采用化學(xué)農(nóng)藥防治芒果炭疽病，引入的不安全因素較多，不僅毒害有益的微生物并導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，還會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。植物提取液防治芒果炭疽病的方法成本較高，工作量大。生物制劑具有用量少、無(wú)殘留、無(wú)公害、不形成抗性等特點(diǎn)，是防治芒果炭疽病的理想選擇，應(yīng)用拮抗微生物防治芒果炭疽病害雖然在國(guó)內(nèi)外已有一些報(bào)道[9-15]，但大多都是在采前進(jìn)行防治，采后防治研究也大多局限于離體實(shí)驗(yàn)。本研究在離體實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)芒果活體進(jìn)行接種和浸蘸實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)其自然炭疽病發(fā)病率，該方法與實(shí)際情況相結(jié)合更具有實(shí)用評(píng)價(jià)價(jià)值，為進(jìn)一步把生物防治芒果炭疽病的方法應(yīng)用到實(shí)際打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

芒果炭疽菌 由中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供；拮抗菌株B2-1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院果蔬保鮮實(shí)驗(yàn)室分離篩選獲得；PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15～20g，蒸餾水1000mL；NB培養(yǎng)基 蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL。

1.2 拮抗菌株B2-1的分離篩選

取10g感染芒果炭疽病的芒果果皮病健交界處，用無(wú)菌水進(jìn)行表面沖洗，晾干，切成長(zhǎng)度和寬度為5mm×5mm、厚度為1mm左右的小塊組織，依次用75%乙醇（v/v）、5%NaClO（v/v）分別進(jìn)行30s、5min的表面消毒，再用無(wú)菌水中漂洗3次，研碎，然后轉(zhuǎn)入裝有100mL無(wú)菌水的200mL三角瓶中，在28℃下180r/min振蕩培養(yǎng)20min，取原液按常規(guī)稀釋法稀釋成10-2、10-3、10-4，然后各取120μL（包括原液）涂板，28℃下培養(yǎng)。根據(jù)平板上長(zhǎng)出的菌落形態(tài)，挑取形態(tài)有差異的細(xì)菌菌落，純化后用對(duì)峙培養(yǎng)法作抗性初篩[16]。在PDA平板中央接種6mm芒果炭疽病的菌落的圓柱形瓊脂塊，28℃恒溫培養(yǎng)24h，在芒果炭疽病菌菌落圓片周圍3cm處沿四個(gè)方向，對(duì)稱點(diǎn)種分離得到的細(xì)菌，一周后觀察抑菌帶產(chǎn)生情況[15]，選擇抑菌帶最寬的1個(gè)菌株作為芒果炭疽病菌的拮抗細(xì)菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 離體抑菌活性的測(cè)定

1.3.1 拮抗菌株B2-1發(fā)酵濾液對(duì)芒果炭疽菌絲的抑制作用 NB液體培養(yǎng)基100mL，滅菌后接種一環(huán)活化的B2-1菌種，25℃下180r/min振蕩培養(yǎng)72h，將此發(fā)酵液用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾，然后用熔化的PDA培養(yǎng)基進(jìn)行濃度稀釋，分別稀釋為原濃度的20%、10%和5%，然后將其倒入滅菌的培養(yǎng)皿中冷卻凝固成平板，在平板中央接種6mm的芒果炭疽病圓形瓊脂塊，對(duì)照用PDA培養(yǎng)基代替稀釋的發(fā)酵濾液。28℃恒溫培養(yǎng)，待對(duì)照菌落布滿平板時(shí)，測(cè)量處理菌落的直徑。每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)。計(jì)算拮抗細(xì)菌培養(yǎng)濾液對(duì)芒果炭疽病菌絲的抑制率，抑制率計(jì)算公式[17]如下：

抑制率（%）=[（對(duì)照菌落凈生長(zhǎng)直徑－處理菌落凈生長(zhǎng)直徑）/對(duì)照菌落凈生長(zhǎng)直徑]×100

1.3.2 拮抗菌株B2-1揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)芒果炭疽菌絲的抑制作用 采用平板對(duì)扣法[18]，在NB平板上接種200μL的B2-1發(fā)酵液（另一處理NB平板涂滿拮抗菌株B2-1），PDA平板中央接種6mm的病菌菌餅后，去皿蓋后與接種B2-1發(fā)酵液的NB平板皿底相扣，然后用保鮮膜封好兩皿底相扣處的邊緣，接種拮抗細(xì)菌B2-1的平板在上，置于28℃恒溫培養(yǎng)。以只接種病菌菌餅的PDA平板和不做任何處理的NB平板對(duì)扣為對(duì)照，7d后測(cè)量病菌菌落直徑，計(jì)算抑制率[17]，每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)。

1.3.3 拮抗菌株B2-1非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)病菌菌絲的抑制作用 采用雙平板—濾紙法。先于直徑9cm的培養(yǎng)皿中倒入15mL PDA培養(yǎng)基為底層培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷凝后，將預(yù)先準(zhǔn)備好的邊緣上折的直徑為12cm的無(wú)菌濾紙輕輕貼于PDA平板上，再向?yàn)V紙上倒入10mL PDA培養(yǎng)基為上層培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷卻后，吸取120μL B2-1發(fā)酵濾液均勻涂抹于上層平板，28℃恒溫培養(yǎng)48h后，除去濾紙以及濾紙上所有部分，并在底層培養(yǎng)基中央接入直徑為6mm的芒果炭疽病病菌菌餅，28℃下恒溫培養(yǎng)7d，測(cè)量病菌菌落直徑[19]，計(jì)算抑制率[17]，每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)。

1.4 活體抑菌活性測(cè)定

1.4.1 芒果活體接種實(shí)驗(yàn) 將健康七成熟的芒果用2%NaClO（v/v）浸泡2min，自來(lái)水沖洗干凈，晾干，用消毒的打孔器在果實(shí)的腰部打直徑為5mm、深2mm的傷口。三種處理在傷口部位分別接種20μL的1×108cfu/mL B2-1菌懸液、B2-1發(fā)酵液和450mg/kg的咪酰胺，2h后再共同接種20μL的1×104cfu/mL炭疽病病原孢子菌懸液，以無(wú)菌水代替炭疽病病原孢子菌懸液做對(duì)照，28℃恒溫培養(yǎng)，7～8d后統(tǒng)計(jì)并計(jì)算果實(shí)炭疽病發(fā)病率、可食用果率和病情指數(shù)[9]，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30個(gè)芒果。發(fā)病率、可食用果率、病情指數(shù)的計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[13]。

1.4.2 芒果活體浸蘸實(shí)驗(yàn) 將健康七成熟的芒果用自來(lái)水沖洗干凈，晾干待處理。實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)處理，依次用2L、1×108cfu/mL的B2-1菌懸液、B2-1發(fā)酵液、450mg/kg的咪酰胺做浸蘸，清水浸蘸做對(duì)照，自然條件下晾干后置于28℃下恒溫培養(yǎng)，讓其自然發(fā)病，待對(duì)照炭疽病發(fā)病率達(dá)到50%后，統(tǒng)計(jì)各處理的發(fā)病率，可食用果率和病情指數(shù)[13]，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30個(gè)芒果。

1.5 菌株鑒定

1.5.1 形態(tài)觀察及部分理化特性研究 參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[20]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[21]，進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、革蘭染色以及接觸酶、好氧性等相關(guān)理化參數(shù)的測(cè)定。

1.5.2 16S rDNA測(cè)序 采用TIANGEN細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株B2-1的基因組DNA，以基因組DNA為模板，用細(xì)菌通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增16S rDNA，上游引物27F：5′-GAGAGTTTGATCCT2 GGCTCAG-3′，下游引物1492R：5′-ACGGGCGGTG2 TGTRC-3′。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min、58℃退火1min、72℃延伸1.5min，共36個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)驗(yàn)證正確后，可以進(jìn)行序列測(cè)定，序列測(cè)定由北京華大基因公司完成，然后對(duì)測(cè)序得到的16S rDNA基因序列進(jìn)行Blast分析，根據(jù)Blast結(jié)果并利用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體抑菌活性的測(cè)定

2.1.1 拮抗菌株B2-1發(fā)酵濾液對(duì)芒果炭疽菌絲的抑制作用 從表1結(jié)果得出，拮抗菌株B2-1的發(fā)酵濾液與對(duì)照相比，對(duì)芒果的炭疽菌絲的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，并且發(fā)酵濾液的濃度越高抑制作用越強(qiáng)。當(dāng)B2-1發(fā)酵濾液的濃度達(dá)到20%時(shí)，B2-1發(fā)酵濾液對(duì)芒果炭疽病菌絲的抑制率達(dá)到了84.14%，不同濃度的發(fā)酵濾液對(duì)芒果炭疽病菌絲的抑制效果差異顯著（p<0.05）。

表1 拮抗細(xì)菌B2-1發(fā)酵濾液對(duì)芒果炭疽菌絲的抑制作用Table 1 Effect of antagonistic bacteria fermentation filtrates of B2-1 on mycelia growth of C.gloeosporioides

2.1.2 拮抗菌株B2-1揮發(fā)性及非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)病菌菌絲的抑制作用 從表2可以得出，無(wú)論是拮抗細(xì)菌B2-1菌株還是其發(fā)酵液的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物都不同程度上對(duì)芒果炭疽病菌絲的生長(zhǎng)具有抑制作用，其中B2-1菌株的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物與對(duì)照相比對(duì)，對(duì)芒果炭疽病菌絲抑制效果明顯，B2-1發(fā)酵液的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物和B2-1菌株的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)芒果炭疽病菌絲生長(zhǎng)的抑制效果差異顯著（p<0.05）；B2-1發(fā)酵液的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物與對(duì)照相比，對(duì)芒果炭疽病菌絲具有明顯的抑制作用，抑制率達(dá)到了99.86%，具有較好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)價(jià)值。

表2 拮抗細(xì)菌B2-1揮發(fā)性及非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)病菌菌絲的抑制作用Table 2 Effect of volatile metabolites or non-volatile metabolites produced by the B2-1 strain on mycelia growth of C.gloeosporioides

2.2 活體抑菌活性的測(cè)定

2.2.1 接種實(shí)驗(yàn) 從圖1可以得出，經(jīng)B2-1的發(fā)酵液和菌懸液處理的芒果與對(duì)照相比，分別使芒果的可食用果率提高了79.89%和78.31%，控制芒果發(fā)病率在32.8%和45.5%。在可食用果率這個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)上，B2-1發(fā)酵液處理的芒果與B2-1菌懸液處理的芒果相比，效果無(wú)顯著差異。

圖1 不同處理芒果的發(fā)病率、可食用果率、病情指數(shù)Fig.1 Disease incidence，saleable fruit ratio and disease indexof different treatments

2.2.2 浸蘸實(shí)驗(yàn) 不同浸蘸處理的芒果中，發(fā)酵液浸蘸處理的芒果在各個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)上效果均顯著優(yōu)于其它處理（圖2），與對(duì)照相比芒果炭疽病的發(fā)病率降低了50%。B2-1發(fā)酵液、B2-1菌懸液浸蘸處理的芒果與對(duì)照相比顯著提高了芒果的可食用果率（p<0.05）。

圖2 不同處理芒果的發(fā)病率、可食用果率、病情指數(shù)Fig.2 Disease incidence，saleable fruit ratio and disease index of different treatments

2.3 菌種鑒定

2.3.1 B2-1菌株的形態(tài)觀察及部分理化特性 B2-1菌株的菌落近似圓形，有褶皺，表面濕潤(rùn)，不透明。理化性狀測(cè)定結(jié)果顯示：B2-1菌株呈革蘭氏陽(yáng)性，好氧兼性厭氧菌，接觸酶反應(yīng)陽(yáng)性，淀粉酶水解反應(yīng)陽(yáng)性。依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，將B2-1菌株初步鑒定為芽孢桿菌屬（bacillus spp.）。

2.3.2 分子鑒定 以B2-1菌株的基因組DNA為模板，用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條約1500bp的DNA片段，用DNA回收試劑盒回收該片段進(jìn)行測(cè)序，序列長(zhǎng)度為1424bp。序列與GenBank中16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，菌株B2-1的16S rDNA（1424bp）與芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis）同源性高達(dá)99%。采用MEG A4.0軟件，用N-J法建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），結(jié)果顯示菌株B2-1與枯草芽孢桿菌在同一分支上，遺傳進(jìn)化距離最近。這與形態(tài)學(xué)觀察以及生理特性的測(cè)定結(jié)果相一致，可確定菌株B2-1屬于枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis），命名為bacillus subtilis B2-1，B2-1的16S rDNA的序列已在Genbank中注冊(cè)，序列號(hào)為JN256114。

圖3 基于16S rDNA序列構(gòu)建的B2-1菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹狀圖Fig.3 Phylogenetic tree of B2-1 based on sequences

3 結(jié)論與討論

研究表明，菌株B2-1和其發(fā)酵液的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)芒果炭疽病菌菌絲有很強(qiáng)的抑制作用?？紤]到商業(yè)應(yīng)用價(jià)值，由于熏蒸操作簡(jiǎn)單，成本低，造成交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)小，并且不會(huì)造成果實(shí)表面的物理性傷害，因此采用熏蒸的方法對(duì)采后果蔬進(jìn)行保鮮處理深受歡迎，尤其在缺少浸蘸設(shè)備的發(fā)展中國(guó)家?？梢?jiàn)，B2-1菌株的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)芒果炭疽菌菌絲的抑制作用值得進(jìn)一步進(jìn)行大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)，確定其商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

離體抗菌活性的測(cè)定結(jié)果表明，拮抗菌株B2-1的發(fā)酵液及其發(fā)酵液的揮發(fā)性及非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)芒果炭疽菌絲均具有明顯的抑制作用，B2-1菌株發(fā)酵濾液的濃度越高抑制作用越強(qiáng)，發(fā)酵濾液的濃度與其對(duì)芒果炭疽菌的抑制效果在一定程度上成正相關(guān)。

拮抗菌株B2-1通過(guò)在芒果活體接種實(shí)驗(yàn)測(cè)試表明，經(jīng)B2-1菌懸液及發(fā)酵液處理的芒果發(fā)病率明顯低于對(duì)照，提高了采后芒果的可食用果率，并且B2-1發(fā)酵液浸蘸處理芒果的品質(zhì)明顯優(yōu)于其它處理，且超過(guò)了化學(xué)試劑450mg/kg的咪酰胺的效果，這為進(jìn)一步把生物防治芒果炭疽病的方法應(yīng)用到實(shí)際打下了基礎(chǔ)。

綜合形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特征檢測(cè)以及16S rDNA序列分析，B2-1菌株被鑒定為枯草芽孢桿菌，命名為bacillus subtilis B2-1。

本實(shí)驗(yàn)表明，芒果內(nèi)生枯草芽孢桿菌B2-1對(duì)芒果炭疽病菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，這為生物防治芒果炭疽病提供了新的資源與途徑。為了保證B2-1菌株在芒果生物保鮮的過(guò)程中對(duì)人類健康不會(huì)造成危害，后續(xù)研究將進(jìn)一步測(cè)定bacillus subtilis B2-1安全性，并分離純化其抑菌組分，對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行深入的研究和探討。

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Study on antibacterial activity and identification of
an antagonistic bacterium for controlling anthracnose diseases of mango

LI Chun-ling1，WANG Qing-guo1，*，XU Li-na2，CHEN Qing-min2
（1.College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China；
2.Shandong Research Centre for Safety Engineering and Technology of Fruits and Vegetables，Jinan 251400，China）

Five antagonistic bacteria were obtained from 29 endosymbiotic bacteria.B2-1 strain was found to have the strongest antagonism to C.gloeosporioides.In vitro evaluation of antagonistic activity，whether the fermentation filtrate，volatile metabolites and non-volatile metabolites of B2-1 strain，showed a strong inhibition on the mycelia growth of C.gloeosporioides，the non-volatile metabolites of fermentation broth were able to inhibit the mycelial growth of the C.gloeosporioides by 99.86%.For further study，in vivo tests indicated that cell suspension and fermentation broth of bacteria B2-1 also significantly reduced the incidence of mango anthrax，thus showing a good potential for bio-controlling of anthracnose diseases.B2-1 was identified as bacillus subtilis by its morphological features，physiological-biochemical properties and 16S rDNA sequencing analysis.

mango；antagonisticbacteriumB2-1；Colletotrichumgloeosporioides；antibacterialactivity；identification

TS255.1

A

1002-0306（2012）11-0147-04

2011－11－21 * 通訊聯(lián)系人

李春玲（1987-），女，碩士研究生，主要從事果蔬貯藏與保鮮技術(shù)。