響應(yīng)面優(yōu)化花生分離蛋白提取工藝的研究

章 寶，單 楊，2，*，李高陽(yáng)，2

（1.中南大學(xué)隆平分院，湖南長(zhǎng)沙 410125；2.湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南長(zhǎng)沙 410125）

響應(yīng)面優(yōu)化花生分離蛋白提取工藝的研究

章 寶1，單 楊1，2，*，李高陽(yáng)1，2

（1.中南大學(xué)隆平分院，湖南長(zhǎng)沙 410125；2.湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南長(zhǎng)沙 410125）

采用堿提酸沉法從低變性花生粕中提取花生分離蛋白，以花生分離蛋白提取率為響應(yīng)值，應(yīng)用Box-Behnken Design（BBD）對(duì)堿提溫度、時(shí)間、pH和液料比4因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定堿提的最佳工藝條件為：堿提溫度57.5℃、時(shí)間100min、pH9.2和液料比12∶1；通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定最佳酸沉pH為4.5。在此條件下，花生分離蛋白最高提取率為87.57%，與預(yù)測(cè)值87.88%相對(duì)誤差約為0.4%。

堿提酸沉，響應(yīng)面法，分離蛋白，氨基酸

花生除直接食用外，主要用于榨油。我國(guó)每年可產(chǎn)生125萬(wàn)t的花生餅粕[1]，花生餅粕含蛋白質(zhì)50%左右，其中10%為清蛋白，90%為堿性蛋白，花生蛋白生物價(jià)（BV）為58，蛋白質(zhì)效率比值（PER）為1.7，比面粉和玉米高[2-3]。在植物蛋白資源中，花生蛋白居第三位，占蛋白總量的11%，是較理想的食用蛋白資源[4]。與大豆蛋白相比，具有含腸胃脹氣因子和抗?fàn)I養(yǎng)因子較少的優(yōu)點(diǎn)[5]；與菜籽、棉籽蛋白相比，具有所含毒性物質(zhì)較少的優(yōu)點(diǎn)。影響花生分離蛋白提取率的因素很多，如提取溫度、時(shí)間、pH、液料比等?；ㄉ蛛x蛋白提取工藝的優(yōu)化，多數(shù)采用正交實(shí)驗(yàn)方法，鮮有見(jiàn)到響應(yīng)面法在這方面的研究報(bào)道。響應(yīng)面法是一種優(yōu)化反應(yīng)條件和加工工藝參數(shù)的有效方法，廣泛應(yīng)用于化學(xué)化工、生物工程和食品工業(yè)等方面[6]。與正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相比，響應(yīng)面具有實(shí)驗(yàn)周期短，回歸方程精度高，能同時(shí)研究幾種因素交互作用等優(yōu)點(diǎn)。目前，高純度花生蛋白的制備技術(shù)并不成熟，極大地限制了花生蛋白的應(yīng)用范圍。作為一種經(jīng)典分離蛋白質(zhì)的方法，堿提酸沉法可以用于高純度花生蛋白的制取[7]。本文對(duì)堿提酸沉法制備花生分離蛋白的條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，以期獲得更高的得率，提高操作穩(wěn)定性，為工業(yè)化生產(chǎn)提供有效技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1材料與設(shè)備

花生粕 實(shí)驗(yàn)室超臨界CO2制備，低變性脫脂花生粕粉碎后過(guò)100目篩，總蛋白54.88%、灰分3.83%、脂肪2.06%、水分5.53%；氫氧化鈉、鹽酸 北京金輝通業(yè)化工有限公司，分析純。

Foss Kjeltec 2300全自動(dòng)凱氏定氮儀 福斯中國(guó)有限公司；電子天平 FA1104型，上海燕恒實(shí)業(yè)有限公司；JJ-150W電子恒速攪拌器 上海比朗儀器有限公司；HJ9025型pH計(jì) 上海器宏科學(xué)儀器設(shè)備有限公司；水浴鍋 XMT-DA數(shù)顯調(diào)節(jié)儀，余姚市亞顯儀器儀表有限公司；DS-1高速組織搗碎機(jī) 江蘇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；TGL-20M臺(tái)式高速離心機(jī) 上海恒科有限公司；日立L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 江蘇同生科技有限公司；PH-1500小型高速噴霧干燥器 上海高機(jī)生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花生分離蛋白提取工藝流程

1.2.2 檢測(cè)方法 蛋白質(zhì)：GB 5009.5-2010；水分：GB 5009.3-2010；脂肪：GB/T 5512-2008；灰分：GB 5009.4-2010；氨基酸分析[8]：采用日立L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定分析。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 對(duì)影響花生分離蛋白提取率的液料比、堿提溫度、堿提時(shí)間和pH 4個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，并確定各因素響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)取值范圍。提取率按下式計(jì)算：

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken 4因素3水平的響應(yīng)面（RSM），以堿提溫度、時(shí)間、液料比和pH為實(shí)驗(yàn)因素（自變量），以花生分離蛋白的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)（響應(yīng)值），分別進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸方程擬合及優(yōu)化分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experimental design factors

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 堿提時(shí)間對(duì)花生分離蛋白提取率的影響 在堿提pH9.0，液料比為10∶1，堿提溫度50℃，堿提2次的條件下，考察不同浸提時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5h）對(duì)花生分離蛋白提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，在堿提時(shí)間小于1.5h時(shí)，分離蛋白提取率隨著堿提時(shí)間的增加而增加，當(dāng)時(shí)間大于1.5h時(shí)，分離蛋白的提取率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)明顯變化。即時(shí)間達(dá)到1.5h時(shí)，蛋白的溶出率已達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。因此，從節(jié)省時(shí)間和能耗的角度考慮，選擇1.5h為最佳堿提時(shí)間。

圖1 堿提時(shí)間對(duì)花生分離蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on peanut protein isolate yield

2.1.2 堿提pH對(duì)花生分離蛋白提取率的影響 在液料比為10∶1，堿提溫度50℃，堿提2次，每次1.5h的條件下，考察不同堿提pH（7.5，8.0，8.5，9.0，9.5）對(duì)花生分離蛋白提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可以看出，堿提pH對(duì)分離蛋白提取率有很大影響，pH小于8時(shí)，花生分離蛋白的提取率的增加緩慢，pH在8～9時(shí)，隨著pH的增加，分離蛋白提取率增加迅速，當(dāng)pH大于9時(shí)，花生分離蛋白的提取率變化不明顯，并且隨著pH的升高提取液粘度增加，不利于下一步的離心分離過(guò)程；另外，加入過(guò)多的堿會(huì)使花生分離蛋白口感帶有咸苦味，從而限制花生分離蛋白的進(jìn)一步利用[9]。而且堿性太強(qiáng)還會(huì)引起脫氨、脫羧和肽鍵斷裂，引起胱賴反應(yīng)，將氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸净衔颷10]。故初步確定堿提pH為9.0。

圖2 堿提pH對(duì)花生分離蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of extraction pH on peanut protein isolate yield

2.1.3 堿提溫度對(duì)花生分離蛋白提取率的影響 在液料比為10∶1，堿提pH9.0，堿提2次，每次1.5h的條件下，考察不同堿提溫度（30、40、50、60、70℃）對(duì)花生分離蛋白提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 堿提溫度對(duì)花生分離蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on peanut protein isolate yield

由圖3可以看出，當(dāng)溫度小于60℃時(shí)，隨著溫度的升高，分離蛋白的提取率隨之增加，但當(dāng)溫度大于60℃后，蛋白的提取率反而下降。主要原因是溫度高于65℃時(shí)蛋白質(zhì)開(kāi)始變性，溫度高于80℃時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)形成凝膠，所以堿提溫度過(guò)高，不僅會(huì)使蛋白變性，影響其功能性，而且粘度增加，分離困難，分離能耗提高[11]。初步確定堿提溫度為60℃。

2.1.4 液料比對(duì)花生分離蛋白提取率的影響 在堿提pH9.0，堿提溫度50℃，堿提2次，每次1.5h的條件下，考察不同液料比（5∶1，10∶1，15∶1，20∶1）對(duì)花生分離蛋白提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 液料比對(duì)花生分離蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of ratio of liquid and material on peanut protein isolate yield

由圖4可知，液料比小于10∶1時(shí)，隨液料比的增加，分離蛋白的提取率有所增加，但當(dāng)液料比大于10∶1后，分離蛋白的提取率隨液料比的增加無(wú)明顯變化。當(dāng)液料比達(dá)到10∶1時(shí)，蛋白的溶出率已達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，初步確定液料比為10∶1。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

對(duì)以上4個(gè)單因素使用Design-Expert 8.0.1軟件設(shè)計(jì)4因素3水平共29個(gè)實(shí)驗(yàn)（5個(gè)中心點(diǎn)）響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。這29個(gè)實(shí)驗(yàn)分為兩類(lèi)：其中24個(gè)析因點(diǎn)為自變量取值在各因素所構(gòu)成三位頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域中心點(diǎn)，重復(fù)5次，用于估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。

2.2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2 模型建立及顯著性檢驗(yàn) 對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到花生蛋白提取率（Y）對(duì)堿提溫度（X1）、堿提時(shí)間（X2）、液料比（X3）和堿提pH（X4）二次多項(xiàng)回歸模型為：

對(duì)該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，模型P＜0.0001，說(shuō)明該模型高度顯著，失擬項(xiàng)P=0.0535＞0.05，說(shuō)明該模型失擬項(xiàng)不顯著，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9913，Radj2=0.9827，說(shuō)明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合好，實(shí)驗(yàn)誤差??；信噪比Adeq Precision=33.949＞4，說(shuō)明該模型可得到足夠強(qiáng)相應(yīng)信號(hào)，因此可以用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。由表4可看出，模型一次項(xiàng)X2、X3、X4高度顯著，X1顯著；交互項(xiàng)X1X2高度顯著，X1X4、X2X3影響顯著，其他交互項(xiàng)不顯著；二次項(xiàng)X12、X22、X32、X42影響也高度顯著。表明各影響因素對(duì)花生分離蛋白提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。通過(guò)直接比較方程中一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小來(lái)判斷因素影響的主次性，對(duì)花生分離蛋白提取率影響因素由大到小依次是：X3＞X4＞X2＞X1，即液料比＞pH＞時(shí)間＞溫度。

表2 Box-Behnken模型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and model test results

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

2.2.3 提取工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化 響應(yīng)面的圖形是響應(yīng)值對(duì)各實(shí)驗(yàn)因素的值所構(gòu)成的一個(gè)三維空間在二維平面上的等高圖[12]。響應(yīng)面曲線較陡，表明影響因子的影響較為顯著，響應(yīng)值變化較大；曲線較為平滑，表明影響因子的影響較小，響應(yīng)值變化較小。由圖5可看出，X1、X2交互作用高度顯著，X1、X4和X2、X3交互作用顯著，其他交互項(xiàng)不顯著。根據(jù)響應(yīng)面分析得到的最佳工藝參數(shù)：堿提溫度57.41℃，時(shí)間1.67h，液料比12.14∶1，pH9.22。在此條件下，花生分離蛋白的提取率的理論預(yù)測(cè)值為87.88%。

考慮到實(shí)際操作的局限性，故將實(shí)際提取工藝條件修正為堿提溫度57.5℃、時(shí)間100min、液料比12∶1、pH9.2，在修正條件下進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，分離蛋白的提取率平均值達(dá)到87.57%，與理論值相對(duì)誤差約為0.4%。此條件下制備的花生分離蛋白的純度為94.58%。由此可見(jiàn)，響應(yīng)面分析的優(yōu)化結(jié)果與實(shí)際值較吻合，且能獲得高純度花生分離蛋白，得到的提取工藝條件具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

表4 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Regression coefficient significance test results

圖5 各兩因素交互作用對(duì)提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surfaces plot showing the effects of temperature and time，temperature and ratio of liquid and material，temperature and pH，time and ratio of liquid and material，time and pH，and ratio of liquid and material and pH on extraction yield of peanut protein isolate

2.3 酸沉pH條件的確定

分別稱取5份10.0g花生粕，在堿提條件為溫度50℃、液料比10∶1、時(shí)間1.5h、pH9進(jìn)行堿提，得到的堿提液于不同的pH（4.1，4.3，4.5，4.7，4.9）條件進(jìn)行酸沉，測(cè)得分離蛋白的得率，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6可看出，花生分離蛋白提取率隨pH的升高，先增加后減少，在pH4.5時(shí)，分離蛋白的提取率達(dá)最大值，初步判定花生分離蛋白的等電點(diǎn)為pH4.5，故選擇pH4.5為最佳酸沉pH。

圖6 酸沉pH對(duì)花生分離蛋白提取率的影響Fig.6 Effect of acid precipitation pH on peanut protein isolate yield

2.4 低變性花生粕和花生分離蛋白的氨基酸含量比較

由表5可知，花生分離蛋白中共檢測(cè)到17種氨基酸，氨基酸總含量為93.63g/100g，而低變性花生粕的氨基酸含量?jī)H為54.60%?；ㄉ蛛x蛋白中成人必需的7種氨基酸（色氨酸未測(cè)出）含量達(dá)24.99g/100g，占氨基酸總量的26.69%。花生分離蛋白中的17種氨基酸含量都超過(guò)了1g/100g，其中谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸的含量較高，均超過(guò)了10g/100g。花生分離蛋白必需氨基酸含量與FAO模式相比賴氨酸和蛋氨酸含量較低，而其他氨基酸成分含量較平衡。

3 結(jié)論

對(duì)花生分離蛋白堿提工藝條件進(jìn)行了單因素和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示液料比、pH及時(shí)間對(duì)花生分離蛋白提取率的影響極顯著，溫度的影響顯著，影響作用按主次順序排列為液料比＞pH＞時(shí)間＞溫度。確定最佳堿提溫度57.5℃，堿提2次，每次100min，堿提液料比為12∶1，堿提pH9.2。并對(duì)酸沉pH進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)，得到最佳酸沉pH為4.5。在此工藝條件下，制得花生分離蛋白產(chǎn)品得率最高可達(dá)87.57%。制備的花生分離蛋白的氨基酸種類(lèi)及含量非常豐富，所含的17種氨基酸含量均超過(guò)1g/100g，其中谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸的含量較高，都超過(guò)了10g/100g，將其添加到其他谷物中，起到氨基酸互補(bǔ)作用，對(duì)開(kāi)發(fā)營(yíng)養(yǎng)保健品有著重要作用。

表5 花生蛋白氨基酸組成含量（g/100g）Table 5 Amino acid composition of peanut protein content

制備的花生分離蛋白的純度為94.58%，采用噴霧干燥可提高花生分離蛋白的組織狀態(tài)，進(jìn)而改善其乳化性、持水性等相關(guān)的特性，使其能廣泛應(yīng)用于肉制品、乳制品、焙烤食品及保健食品等。響應(yīng)面優(yōu)化得到的花生分離蛋白提取工藝條件對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有重要的參考價(jià)值。

[1]劉傳富，張兆靜.花生蛋白及其在食品中的應(yīng)用[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2005（1）：24-25.

[2]周瑞寶.花生加工技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003.

[3]劉大川，張維農(nóng)，胡小泓.花生蛋白制備工藝和功能特性的研究[J].武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001（4）：1-3.

[4]Ramachandran S，Singh S K，Larroche C.Oil cakes and their biotechnological applications-a review[J].Bioresource Technology，2007，98（10）：2000-2009.

[5]裴劍慧，王強(qiáng)，周素梅.我國(guó)花生蛋白資源的開(kāi)發(fā)與利用[J].糧油加工與食品機(jī)械，2005（12）：53-55.

[6]吳有煒.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理[M].蘇州：蘇州大學(xué)出版社，2002：135-142.

[7]Jangchud A，Chinnan M S.Properties of peanut protein film：sorption isotherm and plasticizer effect[J].Lebensam Wiss u Technol，1999，32：89-94.

[8]任健，鄭喜群，王文俠，等.葵花粕中分離蛋白的成分及特性[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2007，23（6）：252-255.

[9]楊偉強(qiáng)，禹山林，袁濤.堿提酸沉法制取花生分離蛋白工藝研究[J].花生學(xué)報(bào)，2008，37（4）：12-17.

[10]邵佩蘭，徐明.提取大豆分離蛋白的工藝研究[J].糧油加工與食品機(jī)械，2005（9）：47-51.

[11]張立偉.富硒菜籽蛋白產(chǎn)品的制備、功能特性及應(yīng)用研究[D].武漢：武漢工業(yè)學(xué)院，1995.

[12]王雪，王振寧.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取黑木耳多糖的工藝研究[J].中國(guó)林副特產(chǎn)，2009，3（3）：1-5.

Optimization of processing parameters for extraction of peanut protein isolate by response surface methodology

ZHANG Bao1，SHAN Yang1，2，*，LI Gao-yang1，2
（1.Longping Branch Graduate School，Central South University，Changsha 410125，China；2.Hunan Agricultural Product Processing Institute，Changsha 410125，China）

Peanut protein isolate was prepared through alkaline extraction and acid precipitation from low variability peanut meal.The optimal values of theoretical parameters including extraction temperature，ratio of liquid and material，extraction time and extraction pH were investigated by Box-Behnken surface response design method.The optimum conditions of alkaline extraction were as followed：extraction temperature 57.5℃，ratio of liquid to material 12 ∶1，extraction time 100min and pH 9.2.And based on the single-factor test，the optimum pH4.5 of acid precipitation was determined.Under these conditions，the maximum protein extraction rate of 87.57%was obtained.The relative error with predicted value was 0.4%.

alkali extraction and acid precipitation；response surface methodology；protein isolate；amino acid

TS201.1

B

1002-0306（2012）11-0270-05

2011－09－29 * 通訊聯(lián)系人

章寶（1986-），男，在讀研究生，研究方向：食品加工與綜合利用。

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（200903043）；湖南省產(chǎn)學(xué)研結(jié)合專(zhuān)項(xiàng)（2009XK6001）。