實(shí)驗(yàn)考察柴胡與黃芩配伍前后柴胡皂苷a、d的溶出性差異

侯緒浩，劉逢芹，楊曉靜，劉田云

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南250355;2.山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院，山東濟(jì)南250014)

中藥柴胡與黃芩配伍應(yīng)用在中醫(yī)臨床極為常用，是中藥方劑中的傳統(tǒng)藥對(duì)［1］，研究表明兩藥配伍后可明顯提高其相關(guān)藥理藥效作用［2，3］。為探討該藥對(duì)配伍前后藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的異同和配伍的合理性，筆者對(duì)藥對(duì)配伍前后提取出的主要藥效成分進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)比較，結(jié)果顯示藥對(duì)配伍對(duì)主要藥效成分黃芩苷影響不大［4］，本文又采用HPLC法實(shí)驗(yàn)考察了藥對(duì)配伍前后柴胡主要藥效成分柴胡皂苷a和d的含量變化，以期從實(shí)驗(yàn)藥學(xué)角度闡明中藥配伍應(yīng)用的機(jī)理，促進(jìn)臨床的組方配伍和合理用藥。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 HPLC色譜儀(Waters公司產(chǎn)品)，Waters 600色譜泵，Waters 2996紫外檢測(cè)器，Waters717自動(dòng)進(jìn)樣器，Empower工作站;BCP225D型十萬(wàn)分之一分析天平(賽多利斯儀器有限公司);KQ－100DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn))，0.45 μm有機(jī)微孔濾膜(上海市新亞凈化器件廠生產(chǎn))。

1.2 試藥 藥材柴胡(批號(hào) 20060501)、黃芩(批號(hào)20070601)購(gòu)于山東天一中藥飲片有限公司，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院生藥專家鑒定為唇形科多年生植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根和傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.(北柴胡)的干燥根;柴胡皂苷a、d均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為110777－200406、110778－200505;甲醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20070110，色譜純)，乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20070606，色譜純)，正丁醇(天津市化學(xué)試劑一廠產(chǎn)品，批號(hào)20061218，分析純)，水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20080102)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);以乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;流速:1 mL·min－1;檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm;柱溫:室溫;進(jìn)樣量:10 μL;理論塔板數(shù)以柴胡皂苷a峰計(jì)算不低于3 000。按以上條件進(jìn)行測(cè)定，可使供試品中柴胡皂苷a、d色譜峰得以分離，且峰形良好，見(jiàn)圖1。

表1 梯度洗脫順序

圖1 柴胡－黃芩藥對(duì)的HPLP圖譜

2.2 供試溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取柴胡皂苷a對(duì)照品約15 mg、柴胡皂苷d對(duì)照品約15 mg，精密稱定，置同一容量瓶中，加甲醇溶解至50 mL，制成每1 mL約含柴胡皂苷a 300 μg，柴胡皂苷d 300 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液［5］精密稱取柴胡藥材粗粉5 g、1∶1配比的柴胡黃芩藥對(duì)粗粉10 g，各加70%乙醇500 mL，浸泡0.5 h，回流1.5 h，過(guò)濾，提取液蒸去乙醇，加水適量，分別用乙醚萃取2次(40，40 mL)，棄取乙醚液，提取液水浴蒸至無(wú)乙醚味，冷至室溫再加水飽和的正丁醇液萃取3次(20，20，20 mL)，合并正丁醇溶液，用1%氫氧化鈉溶液洗滌2次(20，20 mL)，再用正丁醇飽和的水洗至中性，蒸去正丁醇，殘?jiān)蛹状?5 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.3 柴胡皂苷a、d測(cè)定方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取柴胡皂苷a、d混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣 5、10、15、20、25 μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(S)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(A)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 柴胡皂苷a、d的線性回歸方程

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取柴胡皂苷a、d混合對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，每次2 μL，檢測(cè)柴胡皂苷a、柴胡皂苷d峰面積積分值，結(jié)果柴胡皂苷a峰面積值的RSD為0.85%、柴胡皂苷d峰面積值的RSD為1.04%，說(shuō)明儀器的精密度良好。

2.3.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取黃芩－柴胡(5 g－5 g)樣品5份，按照2.2.2項(xiàng)下的方法制成供試樣品溶液，分別測(cè)定柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量，樣品中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d含量的RSD分別為2.78%、3.14%，表明重現(xiàn)性較好。

2.3.4 穩(wěn)定性考察 取柴胡皂苷a、d的混合對(duì)照品溶液分別于0、2、6、24 h進(jìn)樣，測(cè)定柴胡皂苷a及柴胡皂苷d的峰面積，計(jì)算其峰面積的RSD分別為1.42%、1.29%，表明柴胡皂苷a、d在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 方法回收率 精密稱取已知含量的柴胡藥材粗粉約1.0 g，置100 mL容量瓶中，加70%乙醇約80 mL，密閉浸泡0.5 h，精密量取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d對(duì)照品混合溶液8 mL，加70%乙醇至刻度，按“2.2.2”項(xiàng)下操作，制備成加樣回收率供試樣品溶液，依照“2.1”項(xiàng)下方法和條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 柴胡皂苷a、d加樣回收率(n=5)

2.3.6 柴胡皂苷a、d含量測(cè)定 取2.2.2項(xiàng)下的各供試品溶液按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，分別測(cè)定柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 黃芩－柴胡配伍藥對(duì)的柴胡皂苷a、d 含量(%)(n=3)

3 討論

3.1 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，黃芩－柴胡“藥對(duì)”配伍后柴胡皂苷a，d的溶出大大提高，柴胡皂苷a的提出量幾乎比柴胡單用的溶出量多一倍，柴胡皂苷d的提出也比配伍前提高了45%，實(shí)驗(yàn)充分說(shuō)明了藥對(duì)混合提取有利于柴胡皂苷部位的溶出。圍繞藥對(duì)配伍展開(kāi)的研究是探索中藥復(fù)方配伍規(guī)律研究的基礎(chǔ)和切入點(diǎn)，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果從化學(xué)成分研究的角度為已被長(zhǎng)期臨床實(shí)踐所證實(shí)的古人配伍用藥理論提供了科學(xué)依據(jù)。

3.2 實(shí)驗(yàn)予試中曾參照中藥傳統(tǒng)提取方法采用水提取，但發(fā)現(xiàn)水作溶媒對(duì)柴胡皂苷的提取效率不佳，且干擾較大，尤其是柴胡皂苷d，水幾乎不能將其提出，認(rèn)為提取溶媒采用乙醇比較合理，更能較為完全地將有效組分提出，參考文獻(xiàn)［5］并經(jīng)多次試驗(yàn)摸索，最后確定采用70%的乙醇溶液提取效果較好，結(jié)果顯示與中藥混煎增溶理論相一致;另外應(yīng)針對(duì)柴胡黃芩之間的配伍比例展開(kāi)相應(yīng)探討，以找出最佳藥對(duì)配比，為臨床合理用藥提供依據(jù)，改革提取工藝，提高中藥材的利用率。

［1］景浩.小柴胡湯臨床應(yīng)用新進(jìn)展［J］.遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，2(1):67 －69.

［2］王憲齡，張麗萍，李連珍，等.柴胡黃芩配伍不同提取部位對(duì)撲熱息痛所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用［J］.中藥藥理與臨床，2005，21(3):10 －11.

［3］王憲齡，申平，李連珍.柴胡黃芩及其不同劑量比例配伍對(duì)小鼠小腸推進(jìn)功能的影響［J］.中藥藥理與臨床，2004，20(4):1 －2.

［4］劉逢芹，劉田云，余曉東，等.RP－HPLC考察黃芩、柴胡配伍對(duì)黃芩苷成分的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009，15(7):3 －5.

［5］霍務(wù)貞，孫嚴(yán)彤，朱盛山.柴胡有效成分提取條件的研究［J］.廣東藥學(xué)，2005，15(4):6 －7.

［6］林東昊，茅仁剛，王智華，等.HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地北柴胡中柴胡皂苷 a、c、d［J］.中成藥，2002，24(5):60 －62.