張穎梅 李一珊 孫偉旭 林 吉 倪 晨

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關(guān)木通及其炮制品馬兜鈴酸A含量對(duì)比研究

張穎梅1李一珊2孫偉旭2林 吉2倪 晨2

（1 廣州王老吉藥業(yè)股份有限公司，廣州 510450；2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510405）

考察關(guān)木通藥材及其炮制品中馬兜鈴酸A的含量變化。采用高效液相色譜法，色譜柱Lichrospher-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇-1%冰醋酸溶液（70:30），流速1.0mL?min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm。柱溫為35℃。醋炙、堿制及鹽炙3種炮制品中馬兜鈴酸A的含量均較生品有所降低，并且堿制后的炮制品降低率最高。這3種炮制方法能夠降低關(guān)木通中馬兜鈴酸A的含量，達(dá)到降低毒性的目的。對(duì)關(guān)木通毒性成分應(yīng)予以足夠的重視，可通過(guò)科學(xué)炮制降低毒性。

關(guān)木通；炮制；馬兜鈴酸A；高效液相色譜法

關(guān)木通為馬兜鈴科植物東北馬兜鈴（Aristolochia manshuriensis kom.）的干燥藤莖，具有瀉熱、降火作用，用于治療口舌生瘡、小便短赤[1]證，為臨床常用的利尿通淋中藥。近年來(lái)，因國(guó)內(nèi)外連續(xù)發(fā)生多起服用馬兜鈴屬植物（其特征成分均為馬兜鈴酸）引起腎臟毒害事件[2-6]，許多國(guó)家禁止此類藥材及藥劑的應(yīng)用，2005年版《中國(guó)藥典》亦取消了關(guān)木通這個(gè)品種。但正如毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的奠基人Paracelsus（1493～1541）所說(shuō)：物質(zhì)本質(zhì)并非毒物[7]，只有在一定劑量下才變成毒物。本研究通過(guò)醋炙、堿制及鹽炙3種炮制方法處理關(guān)木通，采用HPLC法進(jìn)行馬兜鈴酸A的含量測(cè)定[8]，旨在研究不同炮制方法對(duì)關(guān)木通中馬兜鈴酸含量的影響[9]，探索降低關(guān)木通中馬兜鈴酸類成分的制劑方法[10]。

1 儀器與試驗(yàn)藥品

島津高效液相色譜儀（配有SPD-M 20A 230V檢測(cè)器、CTO-20A柱溫箱、DGU-20A5泵、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、LC-solution色譜工作站），實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)（重慶利迪現(xiàn)代水技術(shù)設(shè)備有限公司）、萬(wàn)分之一電子天平（Sartorius BP110s），高速中藥粉碎機(jī)，超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

關(guān)木通飲片（Aristolochia manshuriensis kom.）（批號(hào)：100402）經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室黃海波老師鑒定結(jié)果為馬兜鈴科植物東北馬兜鈴（Aristolochia manshuriensis kom.）。馬兜鈴酸A對(duì)照品，液相用水為超純水，試劑為分析純。

2 炮制品制備

2.1 醋制品 稱取關(guān)木通藥材150g，取20mL陳醋噴淋于藥材表面悶潤(rùn)至醋被藥材吸盡，置砂鍋內(nèi)用文火炒至嗅得藥材固有香味。冷卻、干燥，再次稱重，即為醋制品。

2.2 堿制品 稱取關(guān)木通藥材150g加0.01mol?L-1小蘇打水沒(méi)過(guò)藥面，武火煮沸后改用文火煮至小蘇打水干，用水洗凈后干燥。

2.3 鹽制品 稱取關(guān)木通藥材150g加3g食鹽，用適量清水（能夠完全浸泡藥材）溶化，與藥物拌勻，悶潤(rùn)至鹽水吸盡，置砂鍋內(nèi)用文火炒至顏色加深有焦斑，取出冷卻干燥，再次稱重，即為鹽制品。對(duì)炮制品及原藥材打粉，編號(hào)，備用。

3 方法與結(jié)果

3.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18 5μm（250mm×4.6mm）；流動(dòng)相：甲醇-1%冰醋酸；檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm；流速：1mL?min-1；柱溫：35℃。

3.2 供試品溶液的制備 精密稱取原藥材粉末1g及炮制品粉末，炮制品粉末相對(duì)于原藥材量1g，各3份，分別置于25mL錐形瓶中，加入25ml甲醇，使用封口膜封口，稱定重量，靜置1h后，置于超聲波清洗器中超聲1h，取出后用電子稱進(jìn)行稱定并用甲醇補(bǔ)足重量。搖勻，使用過(guò)濾裝置過(guò)濾。各取濾液2ml，稀釋定容至10ml，過(guò)微孔濾膜，棄去初濾液，收集續(xù)濾液，即得。

3.3 馬兜鈴酸A標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 稱取馬兜鈴酸A對(duì)照品5mg精密稱定（5.01g），加甲醇超聲溶解于10ml容量瓶中，配制成每1mL含馬兜鈴酸0.50mg的溶液，作為500μg?mL-1的對(duì)照品溶液，仔細(xì)量取5ml溶液到25mL容量瓶中，加甲醇定容至25ml，混勻，即為100μg?mL-1對(duì)照品溶液。依此法分別配成100、50、20、10、4、2、0.8、0.4μg?mL-1的對(duì)照品溶液。

3.4 關(guān)木通及其炮制品含量測(cè)定 將上述3.2制作的供試品溶液利用液相高效色譜儀，用波長(zhǎng)250nm、流動(dòng)相為甲醇-1%冰醋酸進(jìn)行洗脫，甲醇在15min內(nèi)由60%至100%，將峰面積值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得出濃度值，計(jì)算其含量。結(jié)果見(jiàn)表1和圖1～5。

表1 關(guān)木通及其炮制品液相色譜圖結(jié)果

圖1 馬兜鈴酸A

圖2 關(guān)木通原藥材

圖3 鹽制關(guān)木通

圖4 小蘇打制關(guān)木通

圖5 醋制關(guān)木通

3.5 線性范圍考察 分別吸取“3.3”項(xiàng)下100、50、20、10、4、2、0.8、0.4μg?mL-1的馬兜鈴酸A標(biāo)準(zhǔn)品溶液10μL。注入高效液相色譜儀，按擬定的色譜條件分別測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量（μg）對(duì)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為= 4062994.3903x +6172.1668，R2= 0.9999。結(jié)果表明，在上述色譜條件下，馬兜鈴酸A在0～1.0μg的范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.6 精密度考察 精密吸取4μg?mL-1的馬兜鈴酸A對(duì)照品溶液10μl連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定馬兜鈴酸A的峰面積，測(cè)得平均峰面積為165675，RSD＝1.1%，表明儀器精密度良好。

3.7 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一藥材供試液10μL，分別于0、3、6、9、12、15h進(jìn)樣，測(cè)定馬兜鈴酸A的峰面積，測(cè)得平均峰面積為386044，RSD＝1.0%，表明供試品穩(wěn)定。

3.8 重復(fù)性考察 取“3.2”制備的藥材供試液，同一濃度取溶液1ml 6份，置于6個(gè)10ml容量瓶中，加乙醇定容后，搖勻，微孔濾膜過(guò)濾，每份進(jìn)樣10μL，測(cè)定馬兜鈴酸A峰面積。測(cè)得平均峰面積為799739，含測(cè)平均值為0.1953，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.572%。表明本方法重復(fù)性良好。

3.9 加樣回收率試驗(yàn) 按“3.2”方法制備關(guān)木通供試品溶液，并測(cè)定其含量。取該藥材供試品溶液6份，分別精密加入馬兜鈴酸A標(biāo)準(zhǔn)品適量，測(cè)定并計(jì)算馬兜鈴酸A的回收率。結(jié)果見(jiàn)表2，馬兜鈴酸A平均回收率0.9992，RSD＝2.239%，表明該方法具有良好的回收率。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6） （%）

4 討論

通過(guò)醋炙、堿制及鹽炙3種炮制方法處理關(guān)木通，與原藥材比較其馬兜鈴酸A含量明顯降低，說(shuō)明通過(guò)科學(xué)炮制可達(dá)到降毒作用。

通過(guò)此次對(duì)比研究，從一個(gè)側(cè)面反映對(duì)于關(guān)木通等有毒中藥材，我們不應(yīng)因噎廢食，采取一刀切的方式，取消此類中藥的臨床使用，而應(yīng)更加深入研究，全面分析如何通過(guò)科學(xué)炮制，從而降低中藥的毒性成分、保留中藥的有效作用，實(shí)現(xiàn)中藥合理用藥。

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1986:121.

[2] LORD G M. Nephropathy caused by Chinese hems in the UK [J]. Lancet, 1999(354):481-482.

[3] VANHERWEGHM J L. Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women:Association widl slimm ing regimen including Chinese herbs[J]. Lancet,1993,13(341):387-391.

[4] 吳松寒.木通所致急性腎功能衰竭二例報(bào)告[J].江蘇中醫(yī),1964(10):12-14.

[5] 洪用森,黃元林,王永鈞.應(yīng)用大劑量木通能腎功能衰竭致死[J].浙江中醫(yī)雜志,1965(12):32.

[6] 黃朝興.邵志平,許菲菲.木通中毒致腎損害的臨床特點(diǎn)及與馬兜鈴酸腎病的聯(lián)系[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志,2000,(10):588-591.

[7] 張橋.衛(wèi)生毒理學(xué)[M]. 3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:72.

[8] 路金才,韓娜,杜曉曦.馬兜鈴酸的測(cè)定方法現(xiàn)狀分析[J].中草藥,2006, 37(7):1112-1114.

[9] 梁生旺.中藥制劑分析[M].北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2003:38.

[10] 劉養(yǎng)清,趙慧輝,侯娜.反相高效液相法測(cè)定關(guān)木通及配伍中藥中馬兜鈴酸A[J].分析化學(xué),2006(特刊):5161-5164.

（本文校對(duì)：王治華 收稿日期：2012-02-15）

Content Changes of Aristolochic Acid-A from Caulis Aristolochiae Manshuriensis and Its Processed Products

Zhang Yingmei1Li Yishan2Shun Weixu2Lin Ji2Ni Chen2

(Guangzhou Wanglaoji Pharmaceutical Company Limited ,Guangzhou 510450, China)

To research the content changes of Aristolochic Acid-A from Caulis Aristolochiae Manshuriensis and its processed products.Chromatographic assay was performed on Lichrospher-C18 column (4.6mm×250mm, 5μm) with methanol-0.1%glacial a cetic acid solution (70:30) as mobile phase, the flow rate was 1.0mL/min and the detection wave length was set at 250nm, the column temperature was 35℃.The content of Aristolochic Acid-A was lower in Vinegar alkali and salt processed products than in crude drugs, and the reduction rate of the alkali processed products was the highest. The three processed method can reduce the content of Aristolochic Acid-A, and achieve the aim of reducing the toxicity. We should attach great importance to the renal toxicity Caulis Aristolochiae Manshuriensis; however, the toxicity can be reduced through scientific processed.

Caulis Aristolochiae Manshuriensis; Processed; Aristolochic Acid-A; HPLC

10.3969/j.issn.1672-2779.2012.06.101

1672-2779（2012）-06-0154-03