齊曉彥，李 春，張 微，劉 寧，*

(1.黑龍江省乳品工業(yè)技術開發(fā)中心(國家乳業(yè)工程技術研究中心)，黑龍江哈爾濱 150086; 2.東北農業(yè)大學食品學院乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030)

黑木耳多糖-乳清蛋白復合物的制備及其抗原性的研究

齊曉彥1，2，李 春2，+，張 微1，劉 寧1，2，*

(1.黑龍江省乳品工業(yè)技術開發(fā)中心(國家乳業(yè)工程技術研究中心)，黑龍江哈爾濱 150086; 2.東北農業(yè)大學食品學院乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030)

蛋白質和多糖在控制條件下通過美拉德反應會發(fā)生一定程度的共價復合，能顯示更優(yōu)越的性能。采用黑木耳多糖作為糖基供體，用糖基化的手段與牛乳中乳清蛋白結合形成木耳多糖－乳清蛋白復合物，并在現有的條件下探索不同質量比與不同反應時間對糖基化進程的影響，采用間接競爭ELISA法測定復合物中β－乳球蛋白和α－乳白蛋白抗原性的影響。結果表明，乳清蛋白與黑木耳多糖質量比為1∶1，反應時間為24h，是糖基化反應最佳條件并且能有效減低乳清蛋白抗原性，其中β－乳球蛋白抗原性降低率為75.7%，α－乳白蛋白抗原性降低率為25%。

黑木耳多糖，多糖提取，乳清蛋白，美拉德反應，抗原性

Key words: auricularia auricula polysaccharides; polysaccharides extraction;whey p rotein; Maillard reac tion;antigenicity

嬰兒配方乳粉中主要的成分是乳清蛋白粉，其中β－乳球蛋白占乳清蛋白的48%，α－乳白蛋白占19%，乳蛋白過敏的人中大約有82%對β－乳球蛋白過敏［1］。如何通過蛋白質改性降低乳蛋白的過敏性是近幾年國內外的研究熱點。糖基化法與酶解法和化學方法比較，使乳清蛋白改性，更好地降低其過敏性。其中相關研究已證實多糖能有效減低乳清蛋白過敏性［2－6］，而國內外關于單糖或低聚糖使蛋白糖基化改善致敏性的研究也比較多［7－8］。實際應用中單糖或低聚糖進行糖苷化后的效果并不理想。而Arita K等人［9］以多糖的復合方式降低大豆蛋白致敏性。黑木耳(Auricularia auricula)，它能提供豐富的多糖，而且由多種組分組成，如水溶性β－D－葡聚糖(葡聚糖Ⅰ)、水不溶性β－D－葡聚糖(葡聚糖Ⅱ)和兩種酸性雜多糖［10］，進一步通過紙層析和氣相層析分析發(fā)現:黑木耳酸性雜多糖組成成分有D－木糖、D－甘露糖、D－葡萄糖和D－葡萄糖醛酸及少量的L－巖藻糖和L－阿拉伯糖［11］。因此，本研究通過提取黑木耳多糖并將其作為糖基供體，探索其對乳清蛋白抗原性的影響，為糖基化能有效降低牛乳過敏性的研究提供基本的技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

六周齡BALB/c雌性小鼠 哈爾濱市獸醫(yī)研究所;黑木耳 實驗室自制;乳清蛋白(蛋白質質量分數94.1%) 新西蘭;β－乳球蛋白(β－LG)、α－乳白蛋白(α－LA) Sigma公司;HRP標記的羊抗鼠IgG 博奧森公司;十二烷基磺酸鈉(SDS)、鄰苯二甲醛(OPA) 國藥集團，其他試劑均為國產分析純。

包被液:濃度為 0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6;稀釋液:濃度為 0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH7.4;洗滌液:磷酸鹽緩沖液(PBS)+0.05% Tween－20;封閉液:磷酸鹽緩沖液(PBS)+5%脫脂乳;終止液:濃度為2mol/L的濃硫酸;自制抗體及酶標記抗體:抗原:分別為β－LG、α－LA、WPI和WPIAAP復合物;酶標二抗:HRP－羊抗鼠IgG(1∶1000)?？贵w:小鼠抗β－LG血清(1∶12800)和小鼠抗α－LA血清(1∶3200)。

UT－1800紫外－可見分光光度計 北京瑞利; DK－8K恒溫水浴鍋 上海博迅;Alpha 1－2/LD plus凍干機 德國CHRIST公司;ZFQ85B旋轉蒸發(fā)儀杭州藍天;TGL－16C臺式離心機 上海離心機械研究所;550型酶標儀 美國伯樂。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑木耳多糖的提取工藝流程 原料預處理→90℃水浴浸提1h→微波加熱10min→4500r/min離心取上清→50℃減壓濃縮→Sevage法3次脫蛋白→95%乙醇醇沉→離心取沉淀→無水乙醇，丙酮，乙醚洗滌沉淀→復溶→蒸餾水透析48h→冷凍干燥24h→精制多糖(AAP)。

1.2.2 苯酚－硫酸法測定多糖含量

1.2.2.1 多糖含量標準曲線的制作 將葡萄糖標準液分別配制成16～72μg/m L，9個樣品中加6%苯酚1m L，98%濃硫酸5m L放置10m in，然后在490nm下測定吸光值。

1.2.2.2 樣品中多糖含量的測定 吸取多糖提取液1m L，定容至100m L，按上述步驟操作測定吸光度，以標準曲線回歸方程計算多糖含量。

1.2.3 木耳多糖－乳清蛋白復合物的制備 將木耳多糖和乳清蛋白按照質量比1∶1、1∶2、1∶4、1∶8溶解于磷酸鹽緩沖液中，制成60g/L的溶液，在－20℃中預凍過夜后，冷凍干燥48h。干燥后樣品磨細，放置于培養(yǎng)皿中，用刺孔的鋁箔封口后放置于裝有溴化鉀的飽和溶液(相對濕度79%)的反應器中，溫度分別控制在50℃反應0～30h，室溫下冷卻，即為乳清蛋白糖基復合物。

1.2.4 褐變程度測定 將待測的樣品用去離子水進行稀釋，使溶液的質量濃度為1g/L，并在420nm條件下測定其吸光值。

1.2.5 游離氨基酸殘留量的測定 采用鄰苯二甲醛法(OPA)［12－13］。OPA試劑的配制:稱取40mg OPA溶于1m L甲醇中，分別加入濃度為0.1mol/L的硼砂25m L，質量分數為20%的SDS 2.5m L及100μLβ－巰基乙醇，用去離子水定容至50m L?，F用現配。將樣品液(質量濃度為1g/L)取200μL稀釋液加入4m L的OPA試劑中，混合后室溫下反應1～2m in，340nm下測定其吸光度。以 L－亮氨酸濃度0～5.0×10－3mol/L制作標準曲線，根據標準曲線回歸方程，計算出樣品的游離氨基酸殘留量的濃度。

1.2.6 抗β－乳球蛋白及α－乳白蛋白多克隆抗體的制備 取10只6周齡健康雌性BALB/c小鼠，首次免疫取(β－LG或α－LA)1.0mg/m L的標準液與等量弗氏完全佐劑充分混勻，每只小鼠0.1m L，腹腔注射。第14和28d換成不完全弗氏佐劑同法進行加強免疫，免疫原的量不變。一周后加強免疫，摘除眼球采血，分離血清，非競爭ELISA法測定抗體效價，分裝后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 木耳多糖－乳清蛋白抗原性的測定 采用間接競爭ELISA法［14］?？乖?用包被液稀釋抗原，100μL/孔加入酶標板中，4℃過夜備用?？乖c初級抗體反應:在反應管中加入一定量的待測樣品或抗原(β－LG或α－LA)和一定量稀釋的小鼠血清。不加抗原或樣品的反應管作為無競爭體系。4℃冰箱過夜。洗滌:恢復至室溫傾去包被液，加 PBST 200μL/孔，洗板3次，每次5m in，扣干。封閉:每孔加200μL 5%脫脂乳粉作為封閉液，37℃保溫1h，以PBST洗滌，扣干。競爭反應:將第一步中抗原或抗體的混合物100μL/孔，于37℃孵育1.5h。洗滌:用PBST洗板3次，扣干。加酶標二抗:每孔加入100μL 1∶1000稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG，37℃孵育1h。洗滌:用PBST洗板3次，扣干。顯色:加入TMB顯色液100μL/孔，37℃暗處反應15～20m in，顯示藍色。終止反應:每孔加50μL 2mol/L濃硫酸以終止反應，顏色變黃。比色:用酶聯免疫檢測雙波長(特征波長490nm，非特征波長630nm)各孔吸光值。通?？乖越档吐视靡韵鹿奖硎?

式中:A樣品和AWPI分別指包被抗原為糖基化產物和WPI反應體系孔在特征波長492nm和非特征波長630nm測得的吸收值的差。

1.2.8 統計分析 文中所列數據至少為3組數據的平均值。數據采用SPSS 13.0軟件進行差異性分析。

2 結果與分析

2.1 黑木耳多糖含量的檢測

糖含量標準曲線回歸方程(圖1):Y=0.0173X－0.0091，相關系數R2≈0.9953。其中，Y表示溶液在490nm處的吸光值。X表示溶液中葡萄糖的含量(μg)。通過苯酚－硫酸法測定木耳多糖含量，得到精制的黑木耳多糖的多糖含量為76.7%。

2.2 木耳多糖和乳清蛋白質量比與反應時間對復合物的影響

L－亮氨酸標準曲線的回歸方程(圖2)為Y= 0.2531X+0.0271，相關系數R2≈0.9976。式中:Y表示溶液在490nm處的吸光值。X表示L－亮氨酸濃度(mol/L)。游離氨基酸殘留量即為糖基化發(fā)應后的復合物中游離氨基酸濃度與未反應的WPI中游離氨基酸的濃度的比值。

圖1 苯酚－硫酸法標準曲線Fig.1 Standard curve by phenol－sulfuric acid method

圖2 L－亮氨酸濃度Fig.2 The concentration of L－leucine

控制反應條件為相對濕度79%，溫度為50℃，木耳多糖和乳清蛋白質量比分別為1∶1、1∶2、1∶4、1∶8，反應時間為0～30h，對復合物褐變指數以及游離氨基酸殘留量的影響分別為如圖3～圖4所示。

統計結果表明，反應時間對復合物的影響顯著(p＜0.05)。由圖可看出，隨著糖基化的反應時間越長，褐變指數逐漸增加，游離氨基酸殘留量逐漸減少，表明發(fā)生了糖基化反應。當時間小于24h，時間對反應進程的影響顯著(p＜0.05)，但是隨著時間增加變化趨于平緩，所以確定反應時間為24h。

由圖3～圖4可知，4種不同質量比的復合物隨著美拉德反應的進行，產物的變化趨勢基本相似。在實驗范圍內，隨著反應時間的延長，褐變程度增加，但是增大的趨勢較為平緩，且不同質量比的復合物差異不明顯。而游離氨基酸殘留量呈逐漸降低的趨勢，當質量比為1∶1、1∶2、1∶4、1∶8，反應時間24h時，游離氨基酸殘留量分別為37.9%、41.6%、62.4%、68.9%，進一步說明，黑木耳多糖中的小分子還原性糖和乳清蛋白的美拉德反應發(fā)生很快，在短時間內就可以達到。適當的質量比不僅可提高反應速度，還可減少副反應發(fā)生。當質量比為1∶1時，游離氨基酸殘留量消耗較多，且褐變程度隨時間延長增加不明顯，因此木耳多糖和乳清蛋白質量比為1∶1較好。

2.3 木耳多糖和乳清蛋白質量比與反應時間對復合物抗原性的影響

利用間接競爭ELISA法測定反應時間及不同質量比對β－乳球蛋白和α－乳白蛋白抗原性降低率，結果如圖5～圖6所示。不同質量比對β－乳球蛋白抗原性降低率的影響顯著(p＜0.05)。由圖5可以看出，隨著乳清蛋白與木耳多糖的質量比不斷增加，β－乳球蛋白抗原性降低率明顯下降，木耳多糖和乳清蛋白質量比為1∶1時能夠最大程度上降低β－乳球蛋白的抗原性，降低率最高可達到75.7%。

圖3 不同質量比對復合物褐變程度的影響Fig.3 Effect ofmass ratio on the degree of browning

圖4 不同質量比對復合物游離氨基殘留量的影響Fig.4 Effect of differentmass ratio on the degree of free amino group content

反應時間小于12h時，β－乳球蛋白的抗原性變化比較平緩，當反應達到24h時，β－乳球蛋白的抗原性最為顯著，隨著時間的延長β－乳球蛋白的抗原性又稍有降低。說明木耳多糖對降低乳清蛋白的過敏性有所影響，反應時間最佳為24h。美拉德反應生成的木耳多糖－乳清蛋白產物改變了抗原活性部位。

圖5 不同質量比和反應時間對β－乳球蛋白抗原性的影響Fig.5 Antigenicity ofβ－LG through different reaction time and mass ratio

不同質量比對α－乳白蛋白抗原性降低率的影響顯著(p＜0.05)。相對于β－乳球蛋白抗原性的降低率，圖6中不同質量比和反應時間對α－乳白蛋白抗原性降低率偏低，相同的是木耳多糖和乳清蛋白質量比為1∶1，反應時間為24h時，α－乳白蛋白的抗原性降低率達到為25%，但是隨著反應時間的延長在30h時α－乳白蛋白的抗原性降低率達到最高為35.7%。達到24h時，α－乳白蛋白和β－乳球蛋白抗原性降低率均達到達到最高，其中β－乳球蛋白是α－乳白蛋白的抗原性降低的2倍以上，這可能由于乳清蛋白中的β－乳球蛋白和α－乳白蛋白具有不同分子結構和過敏原表位產生的結果［15］。

圖6 不同質量比和反應時間對α－乳白蛋白抗原性的影響Fig.6 Antigenicity ofα－LA through different reaction time and mass ratio

3 結論

單因素實驗結果表明，木耳多糖和乳清蛋白的質量比為1∶1時，反應時間為24h的條件下，木耳多糖－乳清蛋白復合物中游離氨基酸殘留量為37.9%，且褐變程度僅為0.21。在此反應條件下，采用間接競爭ELISA法檢測，木耳多糖與乳清蛋白發(fā)生糖基化反應能有效減低乳清蛋白中β－乳球蛋白和α－乳白蛋白的抗原性，其中木耳多糖對β－乳球蛋白的作用比較明顯，反應時間為24h時降低率達到75.7%，而α－乳白蛋白的抗原性變化不明顯，反應時間為24h時僅為25.0%，但α－乳白蛋白在反應時間為30h時抗原性達到最高為35.7%。本研究提取物黑木耳多糖能有效的降低乳清蛋白的抗原性，綜合以上因素，以抗原性低和最大程度上保持復合物的功能特性，最佳的反應條件為黑木耳多糖和乳清蛋白質量比為1∶1，反應時間為24h。

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Study on preparation and antigenicity activity of glycosylation products derived from whey protein and auricularia auricula polysaccharide

QIXiao－yan1，2，LIChun2，+，ZHANG W ei1，LIU Ning1，2，*
(1.Heilongjiang Dairy Technical Development Center(National Dairy Engineering＆Technology Research Center)，Harbin 150086，China;2.College of Food Science＆Technology，Key Lab of Dairy Science of Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

Protein and polysaccharide covalent com p lex through Maillard could form p rotein－polysaccharide conjugations which showed excellent p roperties.And the conjugates of whey p rotein and auricularia auricula polysaccharides(AAP)were stud ied by means of the d ry－h(huán)eating g lycosylated reac tion.Itwas shown thatafter the whey p rotein and Auricularia auricula polysaccharides(AAP)of d ifferentmass ratio reac ting for d ifferent tim e，the antigenicity ofβ－LG andα－LA were estimated by ind irect com petition ELISA.The results ind icated that the g lycolsylation ofwhey p rotein could reduce the antigenicity ofβ－LG andα－LA.The op timum reac tion cond ition were WPIand AAP(1∶1 weight ratio)for 24 hours could reduce the antigenicity of whey p rotein effec tively，The antigenicity of bovine m ilkβ－LG andα－LA was reduced by conjugation w ith AAP，about 75.7%and 25% respectively.

TS252.1

B

1002－0306(2012)19－0232－04

2012－03－27 *通訊聯系人;+為并列第一作者。

齊曉彥(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:食品營養(yǎng)與乳品加工方向。

李春(1977－)，男，博士，研究方向:乳品加工。

“十二五”國家科技支撐計劃(2011BAD09B03);黑龍江省教育廳(11551062)。