響應(yīng)曲面法優(yōu)化大蒜中總酚提取工藝及其抗氧化活性測(cè)定

杜俊娜，陳書(shū)霞*，程智慧，常燕霞，周 靜

(西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

響應(yīng)曲面法優(yōu)化大蒜中總酚提取工藝及其抗氧化活性測(cè)定

杜俊娜，陳書(shū)霞*，程智慧，常燕霞，周 靜

(西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

采用響應(yīng)曲面法對(duì)料液比、提取時(shí)間、不同體積分?jǐn)?shù)酸化甲醇提取劑3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，以料液比、提取時(shí)間、不同體積分?jǐn)?shù)酸化甲醇提取劑為自變量，總酚提取量為響應(yīng)值，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理和響應(yīng)曲面法，研究各自變量及其交互作用對(duì)總酚提取的影響，模擬求得二次多項(xiàng)回歸方程的預(yù)測(cè)模型，并確定料液比1:14(g/mL)、提取時(shí)間31min、80%酸化甲醇為提取劑是最佳的提取條件。在此條件下，總酚提取量為0.67mg GAE/g，模型預(yù)測(cè)值偏差為6.9%，證明所選工藝條件為最佳工藝條件。同時(shí)，用5種方法對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明大蒜具有良好的抗氧化活性。

大蒜；總酚提取量；抗氧化活性；響應(yīng)曲面法

大蒜(Allium sativumL.)為百合科蔥屬植物，在我國(guó)南北均有種植，是人們?nèi)粘Ｉ钪袀鹘y(tǒng)的調(diào)味料和傳統(tǒng)的藥食同源植物。因其含有維生素、硒和含硫化合物等多種生理活性成分，因此在抗動(dòng)脈粥樣硬化[1]、抗癌[2]、保健和預(yù)防[3]、治療多種慢性疾病[4]等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，而這些應(yīng)用與它們的抗氧化活性密不可分。據(jù)研究，成熟大蒜及其成分在內(nèi)皮細(xì)胞中皆表現(xiàn)出抗氧化性損傷的功能[5]，并可在一定程度上抑制癌細(xì)胞的增長(zhǎng)[6]，因此，大蒜常常被當(dāng)做是功能性的食品原料被加以利用[7]。

大蒜總酚不僅是一種天然無(wú)毒的抗氧化劑，也是理想的天然藥物，具有清除自由基、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等作用。同時(shí)在醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)用化學(xué)品等領(lǐng)域也具有重要的應(yīng)用。在目前大蒜多酚提取的工藝方法中，超聲波提取法具有提取效率高、不需高溫、能耗低、提取時(shí)間短等特點(diǎn)。但對(duì)于大蒜料液比、提取時(shí)間、不同體積分?jǐn)?shù)提取劑等工藝參數(shù)尚有較少的研究對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。

響應(yīng)曲面法(response surface methodology，RSM)是一種優(yōu)化反應(yīng)條件和加工工藝參數(shù)的有效方法，可用來(lái)進(jìn)行建模、檢驗(yàn)?zāi)Ｐ秃线m性、因子效應(yīng)的評(píng)估、考察以及尋求因子的最佳操作條件等[8]。近年來(lái)響應(yīng)曲面法已成功地應(yīng)用于天然化合物提取優(yōu)化實(shí)驗(yàn)[9]，與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)相比，具有試驗(yàn)周期短，回歸方程的精度高，能同時(shí)研究幾種因素間的交互作用等優(yōu)點(diǎn)[10]。

本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)曲面法對(duì)大蒜中總酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，分析料液比、提取時(shí)間、不同體積分?jǐn)?shù)提取劑對(duì)總酚提取得率的影響，建立總酚提取的數(shù)學(xué)模型。并采用5種方法分析大蒜的抗氧化活性，為大蒜醫(yī)學(xué)功能的評(píng)價(jià)和相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大蒜(Allium sativumL.)鱗莖于2010年8月取自西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝場(chǎng)大蒜資源圃。采新鮮鱗莖－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

福林肖卡試劑、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl，DPPH)、新亞銅、啡咯嗪、rolox標(biāo)樣 美國(guó)Sigma公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SHIMADZU UV-1700型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；ZMQS 5001型超純水制備儀 法國(guó)Milipore公司；SORVAIL RC-SC-PLUS型高速冷凍臺(tái)式離心機(jī) 美國(guó)Kendro公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波機(jī) 昆山儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝

準(zhǔn)確稱取一定量的大蒜鱗莖于研缽中，加入液氮研磨至粉末，轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，再加入相應(yīng)量的不同提取液，在20℃條件下進(jìn)行超聲波提取，10000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清至絲口瓶中，－20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 提取條件優(yōu)化方案

根據(jù)單因素試驗(yàn)，選取對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大的因素，采用Box-Benhnken模型進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用Design Expert 7.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

1.3.3 總酚提取量的測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu(FC)法[11]。移取待測(cè)溶液300μL提取液，加入700μL蒸餾水，混合均勻后，加入200μL福林肖卡(FC)試劑，混合萃取1min后，加入2mL Na2CO3(10%)溶液，室溫避光靜置2h后，于波長(zhǎng)765nm處測(cè)吸光度。以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y＝17.179x＋0.0147，r2＝0.9991，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出提取液中總酚質(zhì)量濃度/(mg GAE/g，GAE(gallic acid equivalent)表示沒(méi)食子酸等效物)。

1.3.4 抗氧化活性的測(cè)定

1.3.4.1 DPPH清除力

通過(guò)檢測(cè)試驗(yàn)樣品對(duì)有機(jī)自由基DPPH的清除能力可以評(píng)價(jià)其抗氧化性的強(qiáng)弱。試驗(yàn)測(cè)定參照Mimica等[12]的方法。DPPH清除率按下式計(jì)算。

式中：Ai為試驗(yàn)樣品吸光度；Ac為空白對(duì)照吸光度。

1.3.4.2 羥自由基清除力

對(duì)·OH的清除能力測(cè)定參照Sakanaka等[13]的方法。清除率按下式進(jìn)行計(jì)算。

式中：Ai為試驗(yàn)樣品吸光度；Ac為空白對(duì)照吸光度。

1.3.4.3 鐵氰化鉀還原力

樣品的還原能力與抗氧化能力呈正相關(guān)，參照Oyaizu[14]的方法進(jìn)行測(cè)定，還原能力的強(qiáng)弱以波長(zhǎng)700nm處的吸光度表示。

1.3.4.4 銅離子還原力

取1mL提取液，分別加入1mL CuSO4·5H2O(5mmoL/L)，1mL新亞銅(3.75mmoL/L)，于37℃反應(yīng)30min，450nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。Trolox作標(biāo)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y＝0.0016x－0.0175，r2＝0.998，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出提取液中銅離子還原能力相當(dāng)于trolox的含量的質(zhì)量濃度。結(jié)果用mg(trolox等同量)/g表示。

1.3.4.5 金屬螯合力

對(duì)亞鐵的螯合能力測(cè)定參照Ak等[15]的方法。螯合率按下式進(jìn)行計(jì)算。

式中：Ai為試驗(yàn)樣品吸光度；Ac為空白對(duì)照吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)大蒜中總酚提取量的影響

圖1 料液比對(duì)總酚提取量的影響Fig.1 Effect of material / liquid ratio on yield of total phenolic compounds

以80%酸化甲醇為提取劑，提取時(shí)間為30min的條件下，以料液比1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30(g/mL)進(jìn)行試驗(yàn)，不同料液比對(duì)大蒜總酚提取量的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著液體比例的逐漸增加，總酚提取量呈增大趨勢(shì)。但當(dāng)料液比達(dá)到一定量時(shí)，提取劑對(duì)有效成分的提取達(dá)到飽和。再增加提取劑的量，雜質(zhì)成分會(huì)競(jìng)爭(zhēng)溶出而不利于有效成分的提取。而且會(huì)造成的浪費(fèi)，成本增加。因此，在保證提取效果的同時(shí)，可減少提取劑的用量。綜合考慮，料液比以控制在1:15(g/mL)為宜。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)大蒜中總酚提取量的影響

圖2 提取時(shí)間對(duì)總酚提取量的影響Fig.2 Effect of extraction time on yield of total phenolic compounds

以80%酸化甲醇為提取劑，料液比1:10(g/mL)的條件下，以提取時(shí)間20、30、40、50、60min進(jìn)行試驗(yàn)，不同提取時(shí)間對(duì)總酚提取量的影響見(jiàn)圖2。

由圖2可知，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，總酚提取量逐漸增加，在30min前增加較明顯，說(shuō)明時(shí)間越短提取越不充分，在30min后總酚提取量開(kāi)始下降，之后回升，趨勢(shì)平緩，說(shuō)明大蒜中抗氧化物質(zhì)已基本提取完，為縮短工時(shí)、節(jié)省能源，選取最佳提取時(shí)間為30min。

2.1.3 提取劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)大蒜中總酚提取量的影響

在料液比為1:10(g/mL)，提取時(shí)間30min條件下，分別用50%、60%、70%、80%、90%、100%的酸化甲醇進(jìn)行提取。不同體積分?jǐn)?shù)提取劑對(duì)總酚提取量的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，80%酸化甲醇提取率最高，所以選擇80%酸化甲醇為最佳提取劑。

圖3 提取劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)總酚提取量的影響Fig.3 Effect of concentration of extracting agents on yield of total phenolic compounds

2.2 響應(yīng)面法提取條件的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以料液比、提取時(shí)間和不同體積分?jǐn)?shù)提取劑3個(gè)外界因素為自變量，以總酚提取量為響應(yīng)值即因變量，因素編碼及水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Variables and levels in three-variable-three-level Box-Behnken experimental design

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Trials and results of the three-variable-three-level Box-Behnken experimental design

利用Design Expert 7.0軟件，對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到回歸方程方差分析表，見(jiàn)表3。同時(shí)利用該軟件進(jìn)行非線性回歸分析，得到預(yù)測(cè)模型如下：

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variances for the developed regression equation

由表3可以看出，F(xiàn)回歸＝5.33，P＝0.0191＜0.05，表明模型效應(yīng)顯著，不同處理間的差異顯著；各因素中A2、B2、C2效應(yīng)均顯著；A、B、C、A B、A C、BC效應(yīng)不顯著，由此可見(jiàn)，各具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。F失擬＝0.64，說(shuō)明失擬項(xiàng)與凈誤差沒(méi)有顯著的關(guān)聯(lián)，失擬項(xiàng)P＝0.6262＞0.05，不顯著，說(shuō)明回歸方程擬合程度良好。R2＝0.8727，說(shuō)明該回歸方程回歸效果較好；模型的調(diào)整決定系數(shù)R2Adj＝0.7091，說(shuō)明該模型能解釋70.91%響應(yīng)值的變化，因而該模型擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，可信度高，該模型是合適的，可以用此模型對(duì)總酚提取量提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

2.2.2 各因素及交互作用對(duì)總酚提取量的影響

圖4 各兩因素交互作用對(duì)總酚提取量影響的等高線及響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots of the interactive effects of extraction time and concentration of extracting agents on yield of total phenolic compounds

由圖4a可知，以80%酸化甲醇為提取劑，料液比和提取時(shí)間對(duì)大蒜中總酚提取量的交互影響。在提取時(shí)間不變的條件下，隨著提取劑用量的逐漸增加，總酚提取量出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，變化較不顯著。這可能是當(dāng)料液比變大時(shí)，大蒜中的總酚類物質(zhì)與提取劑在單位時(shí)間內(nèi)存在較大的質(zhì)量濃度梯度，擴(kuò)散系數(shù)大，擴(kuò)散速率大。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，有效組分在提取劑中的溶解基本趨于飽和，再加大料液比也不會(huì)促進(jìn)提取。在料液比不變的條件下，隨著時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，總酚提取量也出現(xiàn)了先上升后下降的趨勢(shì)，變化較為顯著，這說(shuō)明總酚提取量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)達(dá)到飽和時(shí)，再延長(zhǎng)提取時(shí)間，反而會(huì)抑制總酚類物質(zhì)的提取。

由圖4b可知，在30min提取時(shí)間下，料液比和提取劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)大蒜中總酚提取量的交互影響。在料液比不變的條件下，總酚提取量隨提取劑體積分?jǐn)?shù)的升高先增加后降低，提取劑體積分?jǐn)?shù)大致在80%時(shí)，總酚提取量最高，70%和90%時(shí)，總酚提取量較低。在提取劑濃度不變的條件下，隨著提取劑用量的逐漸增加，總酚提取量出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)榱弦罕鹊脑龃髸?huì)使大蒜中的總酚類物質(zhì)得到更充分地釋放，總酚提取量上升，當(dāng)大蒜中的總酚提取接近完全時(shí)，再繼續(xù)增大提取劑用量，總酚提取量則出現(xiàn)下降。

由圖4c可知，在1:15(g/mL)料液比條件下，提取時(shí)間和提取劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)大蒜中總酚提取量的交互影響。在提取時(shí)間不變的條件下，同料液比和不同體積分?jǐn)?shù)提取劑的交互作用，以80%酸化甲醇為提取劑的總酚提取量最高。在提取劑體積分?jǐn)?shù)不變的條件下，隨著提取時(shí)間的增加，總酚提取量出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。其原因可能是在剛開(kāi)始提取的時(shí)候，大蒜中的總酚類物質(zhì)與提取劑在單位時(shí)間內(nèi)存在較大的質(zhì)量濃度差，擴(kuò)散速度快，總酚提取量較高，隨著時(shí)間的延伸，部分組織的有效組分的結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致總酚提取量下降。

綜合圖4，在模型濃度范圍內(nèi)選擇出發(fā)點(diǎn)，按照模型(1)使用快速上升法進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化，提取的最佳條件為料液比1:13.76(g/mL)、提取時(shí)間30.91min、提取劑體積分?jǐn)?shù)79.92%，在此條件下總酚提取量的理論值0.72mg GAE/g，可信度為0.7091。

2.2.3 最佳工藝參數(shù)的驗(yàn)證

在最佳條工藝件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，修正工藝參數(shù)為料液比1:14(g/mL)、提取時(shí)間31min、用80%酸化甲醇為提取劑，實(shí)際測(cè)得的總酚提取量0.67mg GAE/g，模型預(yù)測(cè)值偏差6.9%，與理論值較為一致。因此，認(rèn)為利用響應(yīng)面分析法得到的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，得到的提取條件具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.3 最佳工藝提取液的抗氧化活性的測(cè)定

對(duì)采用最佳工藝所得提取液進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定。如圖5所示，DPPH清除率76.2%、羥自由基清除率52.96%、鐵氰化鉀還原力(實(shí)際吸光度)為0.289、銅離子還原力相當(dāng)于1.888mg(trolox等同量)/g、而金屬螯合率為21.43%，說(shuō)明大蒜鱗莖提取液具有很好的抗氧化活性。

圖 5 總酚提取量及抗氧化活性指標(biāo)Fig.5 Total phenolic content extracted under optimized extraction conditions and antioxidant activity

3 結(jié) 論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理以及響應(yīng)面分析法對(duì)大蒜中總酚類物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到料液比、提取時(shí)間、不同體積分?jǐn)?shù)提取劑3個(gè)因素與總酚提取量的回歸模型，經(jīng)檢驗(yàn)證明該模型合理可靠，能較好地預(yù)測(cè)大蒜中總酚提取量。由該模型確定的最優(yōu)工藝條件為料液比1:14(g/mL)、提取時(shí)間31min、提取劑為80%酸化甲醇，在此條件下，得到總酚提取量為0.67mg GAE/g，與理論值0.72mg GAE/g較為一致。同時(shí)，抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果表明大蒜具有很好的抗氧化活性。

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Response Surface Methodology for Optimization of Extraction Conditions of Total Phenolic Compounds from Garlic and Determination of Antioxidant Activity

DU Jun-na，CHEN Shu-xia*，CHENG Zhi-hui，CHANG Yan-xia，ZHOU Jing
(Key Laboratory of Horticultural Plant Germplasm Resources Utilization in Northwest China, Ministry of Agriculture,College of Horticultural Science, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Response Surface Methodology (RSM) was used to optimize extraction parameters (including material/liquid ratio,extraction time and concentration of extracting agents) so as to achieve the maximum extraction yield of total phenolic compounds.Studies were carried out on the respective independent variables (material/liquid ratio, extraction time and concentration of extracting agents) and the interactive effects of these three factors on the total phenolic compounds according to Box-Benhnken design. A mathematical quadratic polynomial regression equation reflecting the relationship between the total phenolic compounds and the above extraction parameters was established. The optimal extraction parameters were obtained as: material/liquid ratio 1:14 (g/mL) , extraction time 31 min, and 80% acidification methanol as extracting agent. Under the optimal condition,the total phenolic content was 0.67 mg GAE/g, and the model prediction deviation was 6.9%. Meanwhile, the antioxidant activity was determined with five different methods, and the results showed that garlic had good antioxidant activity.

garlic；total phenolic compounds；antioxidant activity；response surface methodology

S663.4

A

1002-6630(2012)10-0072-06

2011-05-21

西北農(nóng)林科技大學(xué)唐仲英育種基金項(xiàng)目(A212020911)；西北農(nóng)林科技大學(xué)青年學(xué)術(shù)骨干支持計(jì)劃項(xiàng)目(01140303)；國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(200903018-7)

杜俊娜(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭卟松砼c分子育種。E-mail：dujunna2005@126.com

*通信作者：陳書(shū)霞(1971—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭卟松砼c分子育種。E-mail：shuxiachen@nwsuaf.edu.cn