劉國(guó)榮，孫 勇，李平蘭*

(1.北京工商大學(xué)食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，食品風(fēng)味化學(xué)北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；2.北京市食品研究所，北京 100162；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的異源表達(dá)研究進(jìn)展

劉國(guó)榮1,3，孫 勇2，李平蘭3,*

(1.北京工商大學(xué)食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，食品風(fēng)味化學(xué)北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；2.北京市食品研究所，北京 100162；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素由于其對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的強(qiáng)烈抑菌活性，已成為天然食品防腐劑研究與開發(fā)的熱點(diǎn)。但是受生物合成調(diào)控系統(tǒng)控制，天然細(xì)菌素的產(chǎn)量往往很低而且提取過(guò)程較為復(fù)雜，很難滿足相關(guān)研究和實(shí)際應(yīng)用的需求。為此，許多研究者進(jìn)行過(guò)Ⅱa類細(xì)菌素的異源表達(dá)研究，本文對(duì)該類細(xì)菌素在大腸桿菌、乳酸菌以及酵母菌中的異源表達(dá)研究作較為全面系統(tǒng)的綜述，并指出目前存在的主要問(wèn)題及今后的研究方向。

Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素；單核細(xì)胞增生李斯特菌；異源表達(dá)

乳酸菌及其活性代謝產(chǎn)物與人類的健康密切相關(guān)，常常被有意識(shí)地引進(jìn)食品產(chǎn)品或自然地發(fā)生在食品中，從而使食品擁有人們渴望的風(fēng)味、結(jié)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)及安全性。乳酸菌細(xì)菌素是乳酸菌在代謝過(guò)程中合成并分泌到環(huán)境中的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白類物質(zhì)，它在人體內(nèi)可被降解，具有無(wú)毒、無(wú)殘留，高效、耐酸、耐高溫、無(wú)抗藥性等特點(diǎn)，目前已成為天然防腐劑研究與開發(fā)的熱點(diǎn)[1-2]。

Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素，是指一類具有共同N端YGNGVXaaC序列的抗李斯特菌的小肽，它們是乳酸菌細(xì)菌素中數(shù)量最多且研究最為深入的一群，主要包括片球菌素(pediocin)、腸球菌素(enterocin)等小分子細(xì)菌素。這類細(xì)菌素不僅可以強(qiáng)烈抑制食源性病原菌單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocylogenes)的生長(zhǎng)，而且對(duì)某些腐敗乳酸菌、索絲菌(Brochotrixspp.)、梭狀桿菌(Clostridiumspp.)、芽孢桿菌(Bacillusspp.)、葡萄球菌(Staphylococcusspp.)等都表現(xiàn)有明顯抑制作用，具有很好的控制食品腐敗菌及病原菌的潛在應(yīng)用價(jià)值。此外，與其他細(xì)菌素相比，Ⅱa類細(xì)菌素的抑菌活性較強(qiáng)且具有良好的物理化學(xué)性質(zhì)，是目前公認(rèn)的最有希望應(yīng)用于多種工業(yè)用途的細(xì)菌素[3-4]。

目前，Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的獲得主要是通過(guò)天然生物合成，但是由于其受調(diào)控系統(tǒng)的影響，產(chǎn)量往往比較低，而且從機(jī)體中提取步驟復(fù)雜、得率低，不足以進(jìn)行抑菌作用機(jī)制、構(gòu)效關(guān)系及開發(fā)應(yīng)用研究。另有少量研究報(bào)道可以采用化學(xué)方法合成細(xì)菌素，它是依據(jù)細(xì)菌素的天然氨基酸序列和活性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，通過(guò)固相法合成的細(xì)菌素或類似物，但是價(jià)格比較昂貴，也很難滿足細(xì)菌素相關(guān)研究和實(shí)際應(yīng)用的需求。隨著Ⅱa類細(xì)菌素遺傳學(xué)特征的深入研究及基因工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用，很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)通過(guò)異源分泌表達(dá)生產(chǎn)細(xì)菌素可克服這些不足。已有研究顯示，不同來(lái)源的不同屬、種的乳酸菌可以產(chǎn)生相似的Ⅱa類細(xì)菌素，這說(shuō)明編碼Ⅱa類細(xì)菌素的基因在不同菌株之間是可以轉(zhuǎn)移的[5-7]。

許多實(shí)踐證明，通過(guò)異源表達(dá)生產(chǎn)Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素可以：1)提高細(xì)菌素的產(chǎn)量，以便進(jìn)行細(xì)菌素的作用模式、結(jié)構(gòu)與功能及應(yīng)用性研究；2)減少在目標(biāo)細(xì)胞中細(xì)菌素抗性的發(fā)生，提高其在食品中的抗菌效率；3)在更安全的宿主中生產(chǎn)細(xì)菌素；4)構(gòu)建出對(duì)多種不良微生物都有抑菌活性的細(xì)菌素產(chǎn)生菌；5)構(gòu)建出對(duì)食品環(huán)境有更好適應(yīng)性的重組宿主；6)為乳酸菌提供更好的抗菌特性，使其在作為食品發(fā)酵劑、益生菌制劑、飼料添加劑等時(shí)能更好的發(fā)揮作用[8]。Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的異源表達(dá)研究，不僅可為全面解析Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的異源分泌機(jī)制提供直接證據(jù)，也可為Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供有效途徑，并進(jìn)一步推動(dòng)我國(guó)食品天然生物防腐劑的快速發(fā)展。

近年來(lái)，有許多研究學(xué)者進(jìn)行了乳酸菌細(xì)菌素異源表達(dá)研究，取得了大量的重要成果。本文重點(diǎn)綜述了Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素在大腸桿菌、乳酸菌以及酵母菌中的異源表達(dá)研究。

1 Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的異源表達(dá)概況

乳酸菌細(xì)菌素異源表達(dá)或基因工程技術(shù)的研究從20世紀(jì)90年代開始，在國(guó)外逐漸成為熱點(diǎn)，尤其在歐洲諸國(guó)研究居多，國(guó)內(nèi)近五年開始出現(xiàn)報(bào)道。通過(guò)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，已有近20種乳酸菌細(xì)菌素在10多種宿主菌中表達(dá)，使用的表達(dá)宿主包括大腸桿菌、乳酸菌、酵母菌等，其中表達(dá)的Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素主要有Pediocin PA-1、Enterocin A、Enterocin P、Carnobacteriocin B2、Divercin V41、Piscicolin 126、Mesentericin Y105、Plantaricin 423、Hiracin JM79等，見(jiàn)表1。

表1 已報(bào)道Ⅱa乳酸菌類細(xì)菌素異源表達(dá)Table 1 Previous studies on the heterogenous expression of class Ⅱa bacteriocins from lactic acid bacteria

2 大腸桿菌異源表達(dá)系統(tǒng)

大腸桿菌是細(xì)菌素異源表達(dá)研究中使用最多的宿主，這首先是因?yàn)榇蠖鄶?shù)乳酸菌細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌并不表現(xiàn)抑制活性，所以不必?fù)?dān)心細(xì)菌素對(duì)宿主菌的細(xì)胞毒性作用。其次是因?yàn)榇竽c桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前最完善的異源表達(dá)體系，它的主要優(yōu)點(diǎn)包括：人們對(duì)其遺傳背景、分子生物學(xué)特點(diǎn)、生物化學(xué)特性等方面有較深入的認(rèn)識(shí)，易于人為改造；很多目的基因在大腸桿菌中都能迅速而有效地表達(dá)出目的蛋白，通常能獲得目的蛋白占總蛋白30%～40%的工程菌株；大腸桿菌的培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，表達(dá)條件易于控制，生產(chǎn)成本低廉；很多成熟的表達(dá)載體及宿主菌組合可供選擇，研究者可根據(jù)需要選擇最適組合。目前大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)已被廣泛用于各種工具酶的生產(chǎn)、抗原及疫苗的制備、細(xì)胞因子的生產(chǎn)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究等方面[28]。

對(duì)Ⅱa類細(xì)菌素而言，由于大腸桿菌不能編碼前導(dǎo)肽切除酶，不能對(duì)Ⅱa類細(xì)菌素前體的前導(dǎo)肽進(jìn)行切除，因此，通常采用的表達(dá)策略是直接將成熟Ⅱa類細(xì)菌素基因編碼序列克隆到大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，利用大腸桿菌自身的分泌機(jī)制進(jìn)行分泌表達(dá)。產(chǎn)物多數(shù)不能成功分泌到胞外，大部分以胞內(nèi)融合蛋白形式表達(dá)，而且產(chǎn)物產(chǎn)量和活性差異較大且其分離純化過(guò)程涉及細(xì)胞裂解、酶解等，過(guò)程繁瑣，成本較高[8]。另外，大腸桿菌高效表達(dá)系統(tǒng)還容易形成包涵體，致使重組蛋白的提取、純化及復(fù)性過(guò)程更加困難。此外，由于大腸桿菌菌株本身不具有食品應(yīng)用特性，因此僅表達(dá)產(chǎn)物可用于食品工業(yè)，有一定的局限性。

近年來(lái)，已有許多Ⅱa類細(xì)菌素在大腸桿菌中的異源表達(dá)研究報(bào)道。早在1998年，Miller等[29]就利用PMAL-p2x載體在大腸桿菌中分泌表達(dá)了麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)-pediocin AcH，并發(fā)現(xiàn)該融合蛋白具有與天然Pediocin AcH相似的生物學(xué)活性。這個(gè)實(shí)驗(yàn)首次證明了可以利用大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)信號(hào)肽依賴機(jī)制進(jìn)行Ⅱa類細(xì)菌素的功能性分泌表達(dá)。隨后，其他一些Ⅱa類細(xì)菌素利用大腸桿菌異源表達(dá)生產(chǎn)的研究也陸續(xù)被報(bào)道，如Moon等[19]將Pendiocin PA-1成熟肽基因與帶有His-tag的倉(cāng)鼠二氫葉酸還原酶基因序列融合，在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)成功表達(dá)了His-tag-倉(cāng)鼠二氫葉酸還原酶-pendiocin PA-1，并發(fā)現(xiàn)在利用Xa因子蛋白酶切除融合標(biāo)簽后，重組Pendiocin PA-1具有與天然細(xì)菌素相似的活性，但是產(chǎn)量?jī)H有0.06mg/L。如Richard等[11]依據(jù)大腸桿菌密碼子嗜好性，設(shè)計(jì)合成Divercin V41成熟肽基因，與表達(dá)載體pET-32b中的含有硫氧還原蛋白基因的核苷酸序列融合，在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)成功表達(dá)了可溶性的硫氧還原蛋白-His-tag-divercin V41，該重組蛋白切除融合標(biāo)簽后具有較高的抗李斯特菌活性，純化后產(chǎn)量可達(dá)23mg/L。又如Gibbs等[25]將細(xì)菌素Piscicolin 126基因片段克隆到表達(dá)載體pET-32a上，并配合使用能夠在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成二硫鍵的宿主菌，融合表達(dá)了硫氧還原蛋白-piscicolin 126，切除融合標(biāo)簽后的重組Piscicolin 126具有生物活性，且產(chǎn)量高達(dá)26mg/L。通過(guò)這些成功的例子可以看出，采用以上表達(dá)系統(tǒng)可以獲得大量可溶性的融合目的蛋白，但是存在的共同問(wèn)題就是目的蛋白只有在切除融合標(biāo)簽后才顯示與天然細(xì)菌素相似的抑菌活性，不利于細(xì)菌素的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。

本課題組前期研究建立了Ⅱa類細(xì)菌素Enterocin P在大腸桿菌中的高效異源表達(dá)系統(tǒng)，所得重組細(xì)菌素產(chǎn)量高達(dá)32mg/L[5,30]。該系統(tǒng)所采用的表達(dá)載體為pET-22b(+)，它的N端含有pelB信號(hào)肽序列，為分泌型表達(dá)載體，它可以增加重組蛋白的溶解性、引導(dǎo)其穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜，進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)。而由于細(xì)胞周質(zhì)的氧化環(huán)境更有利于蛋白折疊和二硫鍵的形成，所以有利于獲得可溶的活性蛋白[31]。此外，該載體C端含有6×His標(biāo)簽序列，該融合標(biāo)簽的存在有利于在天然條件下用金屬親和層析純化融合蛋白并阻止大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對(duì)細(xì)菌素的降解，同時(shí)重組蛋白分子上僅融合了6個(gè)組氨酸短肽，可使重組細(xì)菌素在結(jié)構(gòu)和特性上都更加接近天然Enterocin P。

3 乳酸菌異源表達(dá)系統(tǒng)

已有許多研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生細(xì)菌素的發(fā)酵劑在發(fā)酵過(guò)程中可以防止或抑制不良菌的污染，因而將產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌加入到食品中比直接加細(xì)菌素更簡(jiǎn)便、安全。但是并不是所有的工業(yè)乳酸菌都可產(chǎn)生細(xì)菌素，產(chǎn)生細(xì)菌素的菌株也并不一定適應(yīng)細(xì)菌素發(fā)揮作用的環(huán)境，因此可以將細(xì)菌素基因?qū)氩划a(chǎn)生細(xì)菌素的發(fā)酵劑菌株中而使其獲得細(xì)菌素產(chǎn)生的能力，既可以發(fā)酵食品，又可以抑制食品中的腐敗菌和病原菌。而且不同的食品級(jí)乳酸菌菌株可基于它們?cè)谔囟ㄊ称分械奶匦员贿x擇在不同食品中作為細(xì)菌素宿主，從而可構(gòu)建出適應(yīng)于不同類型食品的細(xì)菌素產(chǎn)生菌株。

與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比較，乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)獲得相對(duì)困難，但是乳酸菌本身安全且能夠?qū)⒛康牡鞍追置诘桨?，可放心?yīng)用于食品工業(yè)化生產(chǎn)[8]。截止目前，以乳酸菌為宿主異源表達(dá)細(xì)菌素的研究報(bào)道非常少，存在的主要問(wèn)題是細(xì)菌素異源分泌表達(dá)水平太低，如Sanchez等[18]利用乳酸乳球菌表達(dá)細(xì)菌素Hiracin JM79，獲得了胞外活性重組細(xì)菌素，但是抑菌活性明顯低于原宿主菌株。

此外，還有許多學(xué)者致力于構(gòu)建完全食品級(jí)異源表達(dá)系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素。這是考慮到傳統(tǒng)的乳酸菌表達(dá)載體大多以紅霉素或氯霉素等抗生素抗性基因作為篩選標(biāo)記，雖然這可以為遺傳操作保持一定的選擇壓力并有效選擇轉(zhuǎn)化子，但是將抗生素抗性基因投放到環(huán)境中或人和動(dòng)物體內(nèi)，由于存在抗性因子轉(zhuǎn)移的隱患，可能帶來(lái)生物安全性的嚴(yán)重后果，所以從食品安全角度考慮，含抗生素抗性基因標(biāo)記的微生物不能應(yīng)用于食品生產(chǎn)中[32]。而為了防止使用抗生素抗性標(biāo)記所引起的危害，最有效的辦法是選用對(duì)人體安全的食品級(jí)篩選標(biāo)記替代抗生素抗性標(biāo)記以構(gòu)建食品級(jí)受體及載體系統(tǒng)。

本課題組前期也研究了Ⅱa類細(xì)菌素Enterocin P在食品級(jí)乳酸菌中的異源表達(dá)與分泌，所使用的是食品級(jí)表達(dá)載體pLEB590，該載體完全以乳酸乳球菌DNA構(gòu)建的，它包含pSH 7l復(fù)制子，組成型啟動(dòng)子P45，并以Nisin免疫基因nisI為標(biāo)記基因[16]。對(duì)Nisin敏感的宿主菌因電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入pLEB590而對(duì)Nisin產(chǎn)生免疫性，這為它的應(yīng)用帶來(lái)了極大的方便。此外，提供選擇壓力的物質(zhì)Nisin是公認(rèn)安全的天然食品防腐劑，且nisI基因來(lái)源于乳酸菌自身，這使得將nisI基因作為乳酸菌食品級(jí)篩選標(biāo)記更有優(yōu)勢(shì)。該研究結(jié)果不但拓展了乳酸乳球菌食品級(jí)表達(dá)載體的應(yīng)用范圍，而且為開發(fā)產(chǎn)Ⅱa類細(xì)菌素的工業(yè)化發(fā)酵劑、益生菌制劑等奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。目前，課題組在驗(yàn)證了pLEB590能夠表達(dá)Ⅱa類細(xì)菌素基因的基礎(chǔ)上，開始對(duì)載體pLEB590進(jìn)行改進(jìn)，將組成型啟動(dòng)子P45換成誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如PnisA-MCSTpepN。即構(gòu)建以nisI作為食品級(jí)選擇標(biāo)記的NICE高效誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。

4 酵母菌異源表達(dá)系統(tǒng)

酵母菌是一種單細(xì)胞低等真核生物，培養(yǎng)條件普通，生長(zhǎng)繁殖速度迅速，能夠耐受較高的流體靜壓，用于表達(dá)基因工程產(chǎn)品時(shí)，可以大規(guī)模生產(chǎn)，有效降低了生產(chǎn)成本。而且某些酵母表達(dá)系統(tǒng)具有外分泌信號(hào)序列，能夠?qū)⑺磉_(dá)的外源蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外，因此很容易純化。

以酵母菌為宿主異源表達(dá)細(xì)菌素的報(bào)道相對(duì)較少，其表達(dá)宿主菌主要有釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。目前，存在的主要問(wèn)題是宿主特異性使得產(chǎn)物常常出現(xiàn)無(wú)活性或活性很低的現(xiàn)象，如Sanchez等[18]利用畢赤酵母表達(dá)細(xì)菌素HirJM79，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基對(duì)其抑菌活性影響較大，重組細(xì)菌素的產(chǎn)量明顯高于野生菌株，但是活性卻遠(yuǎn)不及野生菌；van Reenen等[26]利用釀酒酵母表達(dá)Plantaricin 423，其工程菌表現(xiàn)出了抑菌活性，但培養(yǎng)上清液中卻未檢測(cè)出抑菌能力。Beaulieu等[22]利用畢赤酵母表達(dá)片球菌素Pediocin PA-1，雖然獲得了胞外的重組片球菌素，但卻未檢測(cè)出生物抑菌活性。以上均表明構(gòu)建高產(chǎn)且高活性細(xì)菌素的酵母工程菌是可行的，但仍需探索更為優(yōu)良的表達(dá)體系。

5 結(jié) 語(yǔ)

縱觀Ⅱa類細(xì)菌素異源表達(dá)研究現(xiàn)狀可以看出，構(gòu)建高產(chǎn)且高活性細(xì)菌素的基因工程菌是可行性的，但存在以下主要問(wèn)題：細(xì)菌素的異源分泌水平太低；某些異源表達(dá)系統(tǒng)僅適合特定菌株及細(xì)菌素。除解決以上問(wèn)題外，未來(lái)還可以進(jìn)行以下幾個(gè)方面的探索研究。

5.1 在用于食品發(fā)酵的乳酸菌中表達(dá)外源Ⅱa類細(xì)菌素基因

并不是所有的工業(yè)乳酸菌都可產(chǎn)生細(xì)菌素，產(chǎn)生細(xì)菌素的菌株也并不一定適應(yīng)細(xì)菌素發(fā)揮作用的環(huán)境，因此可以將細(xì)菌素基因?qū)氩划a(chǎn)生細(xì)菌素的發(fā)酵劑菌株中而使其獲得細(xì)菌素產(chǎn)生的能力，既可以發(fā)酵食品，又可以抑制食品中的腐敗菌和病原菌，甚至可以根據(jù)不同食品級(jí)乳酸菌菌株在特定食品中的特性而選擇不同食品級(jí)乳酸菌作為細(xì)菌素異源表達(dá)宿主，進(jìn)而構(gòu)建出適應(yīng)于不同類型食品的細(xì)菌素產(chǎn)生菌。

5.2 建立Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素在芽孢桿菌中的異源表達(dá)系統(tǒng)

由于芽孢桿菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化效率低、表達(dá)產(chǎn)物量少以及產(chǎn)物活性受環(huán)境影響大等因素，使得有效芽孢桿菌分泌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建和獲得非常困難，目前有關(guān)細(xì)菌素在芽孢桿菌中的異源表達(dá)還未見(jiàn)研究報(bào)道。但是芽孢桿菌具有良好的分泌特性，其發(fā)酵工藝和產(chǎn)物回收技術(shù)也較為成熟，用作細(xì)菌素的分泌型宿主菌，具有很大的潛力。

5.3 將無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)應(yīng)用于Ⅱa類細(xì)菌素的重組表達(dá)

近幾年，無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)迅速發(fā)展，該系統(tǒng)能使外源基因在體外快速表達(dá)，避免了細(xì)胞體系中宿主菌的復(fù)雜調(diào)控和新陳代謝帶來(lái)的干擾，以及基因工程菌表達(dá)抗菌肽時(shí)對(duì)宿主的毒性作用，可以成為Ⅱa類細(xì)菌素重組表達(dá)的一種有效手段。然而，到目前為止，國(guó)內(nèi)外只有謝燕[33]利用大腸桿菌無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了Ⅱa類細(xì)菌素NB-C1融合蛋白的可溶性表達(dá)。這說(shuō)明有關(guān)Ⅱa類細(xì)菌素在無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的重組表達(dá)研究上還存在很大的探索和發(fā)展空間。

[1] CLEVELAND J, MONTVILLE T J, NES I F, et al. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation[J]. International Journal of Food Microbiology, 2001, 71: 1-20.

[2] DEEGAN L H, COTTER P D, HILL C, et al. Bacteriocins: biological tools for biopreservation and shelf-life extension[J]. International Dairy Journal, 2006, 16(9): 1058-1071.

[3] ENNAHAR S, SASHIHARA T, SONOMOTO K, et al. Class Ⅱa bacteriocins: biosynthesis, structure and activity[J]. FEMS Microbiology Reviews, 2000, 24: 85-106.

[4] 郭興華. 益生乳酸細(xì)菌: 分子生物學(xué)及生物技術(shù)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2008: 219-385.

[5] 劉國(guó)榮. 一種Ⅱa腸球菌素的分離純化、異源高效分泌表達(dá)及應(yīng)用研究[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

[6] 余占橋, 楊芳, 張日俊. 細(xì)菌素異源表達(dá)的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2010, 37(2): 51-55.

[7] 趙愛(ài)珍. Enterocin A結(jié)構(gòu)基因的克隆、功能性表達(dá)及構(gòu)效關(guān)系研究[D]. 長(zhǎng)春: 吉林大學(xué), 2005.

[8] RODRIGUEZ J M, MARTINEZ M I, HORN N. Heterologous production of bacteriocins by lactic acid bacteria[J]. International Journal of Food Microbiology, 2003, 80: 101-116.

[9] QUADRI L E N, YAN L Z, STILES M E, et al. Effect of amino acid substitutions on the activity of carnobacteriocin B2: overproduction of the antiinicrobial peptide, its engineered variants, and its precursor inEscherichia coli[J]. Journal of Biological Chemistry, 1997, 272(6): 3384-3388.

[10] McCORMICK J K, WOROBO R W, STILES M E. Expression of the antimicrobial peptide carnobacteriocin B2 by a signal peptide-dependent general secretory pathway[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(11): 4095-4099.

[11] RICHARD C, DRIDER D, ELMORJANI K, et al. Heterologous expression and purification of active divercin V41, a class IIa bacteriocin encoded by a synthetic gene inEscherichia coli[J]. Journal of Bacteriology, 2004, 186(13): 4276-4284.

[12] INGHAM A B, SPROAT K W, TIZARD M I V, et a1. A versatile system for the expression of nonmodified bacteriocins inEscherichia coliEJ3[J]. Journal of Applied Microbiology, 2005, 98: 676-683.

[13] KLOCKE M, MUNDT K, IDLER F, et al. Heterologous expression of enterocin A, a bacteriocin fromEnterococcus faecium, fused to a cellulose-binding domain inEscherichia coliresults in a functional protein with inhibitory activity againstListeria[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2005, 87(4): 532-538.

[14] GUTIERREZ J, CRIADO R, CITTI R, et al. Cloning, production and functional expression of enterocin P, a sec-dependent bacteriocin produced byEnterococcus faeciumP13, inEscherichia coli[J]. International Journal of Food Microbiology, 2005, 103: 239-250.

[15] GUTIERREZ J, LARSEN R, CINTAS L M, et al. High-level heterologous production and functional expression of the sec-dependent enterocin P fromEnterococcus faeciumP13 inLactococcus lactis[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 72: 41-51

[16] LIU Guorong, WANG Haifeng, GRIFFITHS M W, et al. Heterologous extracellular production of enterocin P inLactococcus lactisby a foodgrade expression system[J]. European Food Research and Technology, 2011, 233(1): 123-129.

[17] GUTIERREZ J, BOURQUE D, CRIADO R, et al. Heterologous extracellular production of enterocin P fromEnterococcus faeciumP13 in the methylotrophic bacteriumMethylobacterium extorquens[J]. FEMS Microbiology Letters, 2005, 248: 125-131.

[18] SANCHEZ J, BORRERO J, GOMEZ-SALA B, et al. Cloning and heterologous production of hiracin JM79, a sec-dependent bacteriocin produced by Enterococcus hirae DCH5, in lactic acid bacteria andPichia pastoris[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(8): 2471-2479.

[19] MOON G S, PYUN Y R, KIM W J. Expression and purification of a fusion-typed pediocin PA-1 inEscherichia coliand recovery of biologically active pediocin PA-1[J]. International Journal of Food Microbiology, 2006, 108: 136-140.

[20] BEAULIEU I, TOLKATCHEV D, JETTE J F, et a1. Production of active pediocin PA-1 inEscherichia coliusing a thioredoxin gene fusion expression approach: cloning, expression, purification, and characterization [J]. Canadian Journal of Microbiology, 2007, 53(11): 1246-1258.

[21] SCHOEMAN H, VIVIER M A, du TOIT M, et al. The development of bactericidal yeast strains by expressing thePediococcus acidilacticipediocin gene (pedA) inSaccharomyces cerevisiae[J]. Yeast, 1999, 15 (8): 647-656.

[22] BEAULIEU L, GROLEAU D, MIGUEZ C B, et a1. Production of pediocin PA-1 in the methylotrophic yeastPichia pastorisreveals unexpected inhibition of its biological activity due to the presence of collagen like material[J]. Protein Expression and Purification, 2005, 43 (2): l11-125.

[23] HORN N, MARTINEZ M I, MARTINEZ J M, et a1. Enhanced production of pediocin PA-1 and coproduction of nisin and pediocin PA-1 byLactococcus lactis[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1999, 65(10): 4443-4450.

[24] MORISSET D, FRERE J. Heterologous expression of bacteriocins using the mesentericin Y105 dedicated transport system byLeuconostoc mesenteroides[J]. Biochimie, 2002, 84(5/6): 569-576.

[25] GIBBS G M, DAVIDSON B E, HILLIER A J. Novel expression system for large-scale production and purification of recombinant class IIa bacteriocins and its application to piscicolin 126[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(6): 3292-3297.

[26] van REENEN C A, DICKS L M, CHIKINDAS M L. Isolation, purification and partial characterization of plantaricin 423, a bacteriocin produced byLactobacillus plantarum[J]. Journal of Applied Microbiology, 1998, 84(6): 1131-1137.

[27] BIET F, BERJEAUD J M, WOROBO R W, et a1. Heterologous expression of the bacteriocin mesentericin Y105 using the dedicated transport system and the general secretion pathway[J]. Microbiology, 1998, 144(10): 2845-2854.

[28] 解庭波. 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2008, 5(3): 77-82.

[29] MILLER K W, SCHAMBER R, CHEN Y, et al. Production of active chimeric pediocin AcH inEscherichia coliin the absence of processing and secretion genes from thePediococcus papoperon[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64: 14-20.

[30] LIU Guorong, GRIFFITHS M W, WU Pengpeng, et al.Enterococcus faeciumLM-2, a multi-bacteriocinogenic strain naturally occurring in Byaslag , a traditional cheese of Inner Mongolia in China[J]. Food Control, 2010, 22: 283-289.

[31] 李碩. IIa類乳酸菌細(xì)菌素的克隆表達(dá)研究[D]. 無(wú)錫: 江南大學(xué), 2009.

[32] 孫強(qiáng)正, 徐建國(guó). 乳酸乳球菌食品級(jí)表達(dá)載體的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 2006, 18(3): 260-261.

[33] 謝燕. 一種新型Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的重組表達(dá)策略研究[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué), 2011.

Research Advances in Heterologous Expression of ClassⅡa Bacteriocins from Lactic Acid Bacteria

LIU Guo-rong1,3，SUN Yong2，LI Ping-lan3,*
(1. Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. Beijing Food Research Institute, Beijing 100162, China；3. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Class Ⅱa bacteriocins from lactic acid bacteria, which have a strong antibacterial activity againstListeria monocytogenes, have become a hot topic in the research and development of natural preservatives. However, the bacteriocins are always produced at very low levels under the control of the biosynthesis regulatory system and their extraction is very complex, which makes it very difficult to meet the demands for relevant studies and practical applications. For this reason, the heterogenous expression of classⅡa bacteriocins has been widely studied in recent years. This paper summarizes a comprehensive systematic review of recent studies on the heterogenous expression of the bacteriocins inE. coli, lactic acid bacteria and yeast and points out the current main problems and future research directions.

classⅡa bacteriocins；Listeria monocytogenes；heterologous expression

Q939.117

A

1002-6630(2012)05-0323-05

2011-12-12

北京工商大學(xué)青年教師科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(QNJJ2011-042)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071591)

劉國(guó)榮(1983—)，女，講師，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)。E-mail：liuguorong@th.btbu.edu.cn

*通信作者：李平蘭(1964—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槿樗峋捌浠钚源x產(chǎn)物的理論與應(yīng)用。E-mail：lipinglan@cau.edu.cn