李春林，高彥祥，袁 芳，王瑩瑩，陶一荻，張曉菲

（中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

亞臨界水中反應參數(shù)對ε-聚賴氨酸與葡聚糖美拉德反應的影響

李春林，高彥祥*，袁 芳，王瑩瑩，陶一荻，張曉菲

（中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

研究了亞臨界水溫度、壓力、時間、pH、反應物質(zhì)量比對ε－聚賴氨酸與葡聚糖之間的美拉德反應速率的影響。通過測定接枝度和褐變指數(shù)評價各種因素對美拉德反應的影響。結(jié)果表明，褐變指數(shù)與溫度、時間、pH呈正相關，與壓力呈負相關;時間、pH、反應物質(zhì)量比對接枝度的影響均是先增大后減小。

亞臨界水，美拉德反應，接枝度，褐變指數(shù)

ε－聚賴氨酸（ε－Polylysine，ε－PL）是經(jīng)白色鏈霉菌（Strptomyces albulus）發(fā)酵產(chǎn)生的一種均聚氨基酸。ε－PL對革蘭氏陽性、陰性菌和真菌等都具有一定的抑制作用，已于2003年10月被FDA批準為安全食品防腐劑［1］。然而在實際應用中，ε－聚賴氨酸易于與蛋白質(zhì)和酸性多糖發(fā)生相互作用，從而導致其抑菌性能的降低，且ε－聚賴氨酸乳化性較差，因而主要用于淀粉基類食物中［2］。近年來，國外學者研究發(fā)現(xiàn)通過美拉德反應形成的蛋白質(zhì)－多糖共價復合物的乳化性及其他特性顯著提高。如Kato等［3］發(fā)現(xiàn)用葡聚糖與溶菌酶進行美拉德反應后，溶菌酶的乳化性和熱穩(wěn)定性都有所提高，而且對革蘭氏陽性菌（G+菌）和革蘭氏陰性菌（G－菌）均有抑制作用。在傳統(tǒng)條件下，美拉德反應速度慢，達到理想反應程度一般需要數(shù)天或者更長，在實際應用中受到了極大的限制［4］。研究表明，外加物理場可以明顯提高蛋白質(zhì)多糖共價復合反應速率，加速復合產(chǎn)物的形成。目前，國內(nèi)外學者主要集中研究微波［5］、超高壓［6］、超聲波［7－8］以及超臨界CO［9］2對蛋白質(zhì)－多糖共價復合反應的影響，而關于亞臨界水對蛋白質(zhì)－多糖共價復合反應的影響研究較少。亞臨界水，亦稱作超熱水、高壓熱水，即通過調(diào)節(jié)適當?shù)膲毫?，將水加熱?00℃以上臨界溫度（374℃）以下的高溫，仍然維持在液體狀態(tài)［10］。作為一種新型的萃取溶劑，亞臨界水已被廣泛運用于植物材料中多酚［11］、精油［12］、蛋白質(zhì)［13］、多糖［14］等活性物質(zhì)的分離提取。提取有效成分的同時，處于亞臨界水環(huán)境中的化學成分在高溫條件下也可能會發(fā)生相互作用，形成與目標產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同的新物質(zhì)。如原料中的蛋白質(zhì)和碳水化合物在高溫水溶液中易于發(fā)生美拉德反應而引起褐變，對于兩者含量豐富的原料尤為顯著。然而對亞臨界水中美拉德反應的研究較少，僅有Merichel等［15］報道了氨基酸和葡萄糖在亞臨界介質(zhì)中反應的可能性，但并未對影響美拉德反應的各種因素進行系統(tǒng)的研究。本文以ε－聚賴氨酸和葡聚糖為實驗原料，以接枝度和褐變指數(shù)為指標，研究亞臨界水環(huán)境中壓力、溫度、時間、pH、反應底物配比等因素對美拉德反應的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ε－聚賴氨酸 浙江銀象生物工程有限公司;葡聚糖（35～45u） Sigma公司;鄰苯二甲醛（OPA）北京金龍化學試劑有限公司，化學純;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、甲醇、十二烷基磺酸鈉（SDS）等 分析純。

CWYF亞臨界水萃取裝置 江蘇華安是由科研儀器設備有限公司;AR1140分析天平 上海奧豪斯國際貿(mào)易有限公司;UV－1800紫外可見分光光度儀

日本島津公司;DSHZ－300恒溫水浴鍋 江蘇太倉市實驗設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 溫度對反應接枝度和褐變指數(shù)的影響 ε－聚賴氨酸與葡聚糖按照質(zhì)量 1∶15的比例溶解于0.067mol·L－1的pH 8.5磷酸緩沖液中，其中ε－聚賴氨酸濃度為0.2%（W/V）。將以上所配制反應液置于亞臨界反應裝置中，通入N2并維持5MPa的壓力下反應60m in。反應溫度分別設定為90、100、110、120、130℃。

1.2.2 壓力對反應接枝度和褐變指數(shù)的影響 ε－聚賴氨酸與葡聚糖按照1∶15的比例溶解于0.067mol·L－1的pH 8.5磷酸緩沖液中，其中ε－聚賴氨酸濃度為0.2% （W/V）。將以上所配制反應液置于亞臨界反應裝置中，110℃下反應60m in。反應壓力分別設定為0、2.5、5.0、7.5、10.0MPa。

1.2.3 pH對反應接枝度和褐變指數(shù)的影響 反應pH分別設定為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。ε－聚賴氨酸與葡聚糖按照1∶15的比例溶解于0.067mol·L－1的不同pH的磷酸緩沖液中，其中 ε－聚賴氨酸濃度為0.2%（W/V）。將以上所配制反應液置于亞臨界反應裝置中，于110℃，5MPa的壓力下反應60m in。

1.2.4 時間對反應接枝度和褐變指數(shù)的影響 ε－聚賴氨酸與葡聚糖按照1∶15的比例溶解于0.067mol·L－1的pH 8.5磷酸緩沖液中，其中聚賴氨酸濃度為0.2% （W/V）。將以上所配制反應液置于亞臨界反應裝置中，110℃、5MPa下反應。反應時間分別設定為30、45、60、75、90m in。

1.2.5 ε－聚賴氨酸/葡聚糖質(zhì)量比對反應接枝度和褐變指數(shù)的影響 設定反應物中總質(zhì)量為3.2%，調(diào)節(jié)葡聚糖與ε－聚賴氨酸的質(zhì)量比值分別為2.5∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1。反應時間設定為110℃、5MPa下反應60m in。

1.2.6 自由氨基含量的測定 采用OPA法計算自由氨基含量。參照文獻［16］的方法基礎上略微改進。準確稱取40mg的OPA溶解于1m L的甲醇中，分別加入 20%（w/w）的 SDS 2.5m L，0.1mol/L的硼砂25m L及100μLβ－巰基乙醇，最后用蒸餾水定容到50m L，此為OPA試劑，且使用前即時配制。

測定時，取OPA試劑4m L置于試管中，注入200μL樣品液，混勻后于35℃反應2min，在340nm下測其吸光值A340，以在OPA試劑中加入200μL水作為空白。以賴氨酸作出標準曲線，計算自由氨基含量。

1.2.7 接枝度的計算［17］接枝度（Degree of Graft，DG）計算公式如下:

其中:C0為未反應時自由氨基總量;Ct為反應t時刻自由氨基的含量。

1.2.8 褐變程度的測定 參照文獻［18］，準確稱量不同條件下的反應產(chǎn)物的凍干粉，配制成蛋白質(zhì)含量為0.2%的溶液。通過紫外可見分光光度計測定420nm處的吸光值表示褐變程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對反應接枝度和褐變指數(shù)的影響

由圖1可以看出，A420吸光值隨著反應溫度的升高而增大。其中90～110℃范圍內(nèi)吸光值增長較為緩慢（A420＜0.1），當溫度升高到120～130℃時，A420急劇增大到0.3以上，褐變比較明顯。

圖1 溫度對接枝度和褐變指數(shù)的影響Fig.1 Effect of temperature on graft and browning index

ε－聚賴氨酸與葡聚糖的接枝度隨著溫度的升高而增大。溫度越高，反應速度越快，在相同的反應時間內(nèi)反應程度越高。其中90～100℃之間，接枝度較低;當溫度升高到110℃時，接枝度由3.6%增大到11.3%。這是因為亞臨界水中，維持一定壓力，升高溫度可以顯著減小水的表面張力和粘度，從而提高了溶質(zhì)在其中的傳質(zhì)系數(shù)［19］，增加了底物分子在溶液中熱運動速率，從而提高了碰撞機率。

2.2 壓力對接枝度和褐變指數(shù)的影響

從圖2可以看出，隨著壓力的增大，接枝度變化不明顯，可能是研究所用 ε－聚賴氨酸僅僅是由20～30個賴氨酸分子組成的肽段，分子結(jié)構(gòu)簡單，缺乏復雜的三四級結(jié)構(gòu)，施加壓力并不會對其結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，所以不會改變其暴露在溶液中的活性基團的濃度。但是A420吸光值卻隨著壓力增大而逐漸降低，說明增大壓力會抑制美拉德反應后期類黑精物質(zhì)的產(chǎn)生，從而減小溶液的褐變程度。Neil等［20］研究壓力對色氨酸與木糖等反應的影響時，發(fā)現(xiàn)壓力抑制類黑精物質(zhì)形成的原因是阻止了阿姆德瑞重排產(chǎn)物（Amadori rearrangement product）的降解，進而阻止了美拉德反應后期類黑精的生成。

2.3 時間對接枝度和褐變指數(shù)的影響

由圖3可以看出，A420隨著反應時間的延長而升高，當反應時間達到75m in時，吸光值達到0.12。蛋白質(zhì)與多糖的反應是建立在兩者活性基團的充分暴露和相互接觸的基礎之上，葡聚糖是多糖，分子較大，與ε－聚賴氨酸的結(jié)合存在著一定的空間位阻。隨著反應時間的延長，ε－聚賴氨酸的氨基與葡聚糖的醛基受熱逐步結(jié)合，反應程度提高。所以接枝度隨著反應時間的延長而逐漸升高。當反應時間超過75m in時，又有所降低，可能是由于加熱時間過長，從而導致聚賴氨酸的降解，或者反應基團的破壞，從而影響了兩者的反應。

圖2 壓力對接枝度和褐變指數(shù)的影響Fig.2 Effect of pressure on graft and browning index

圖3 時間對接枝度和褐變指數(shù)的影響Fig.3 Effect of time on graft and browning index

2.4 pH對接枝度和褐變指數(shù)的影響

從圖4可以看出，隨著pH增大，褐變程度逐漸加深，接枝度增大。當pH高于8.5時，褐變指數(shù)隨pH的升高而急劇增大，這是因為美拉德反應本質(zhì)上是一種堿催化反應，堿性越強，越容易發(fā)生反應，接枝度越大，褐變越嚴重;而中性和偏酸性，氨基易于質(zhì)子化，不利于親和反應的發(fā)生［21］，因此阻礙美拉德反應的進行。但是堿性過強，則有可能會引起蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的變化，如脫胺、脫羧等，反而不利于反應的進行［22］。在pH=9.0時，ε－聚賴氨酸處于等電點附近，溶解度有所降低，溶液中活性氨基濃度降低，因此接枝度有所下降，但在此條件下，葡聚糖發(fā)生焦糖化反應，因而褐變指數(shù)繼續(xù)增大。

圖4 pH對接枝度和褐變指數(shù)的影響Fig.4 Effect of pH on graft and browning index

2.5 ε－聚賴氨酸/葡聚糖質(zhì)量比對接枝度和褐變指數(shù)的影響

蛋白質(zhì)與多糖的美拉德反應在活性基團之間進行。ε－聚賴氨酸分子量低，且自由氨基含量豐富，葡聚糖含量較低時，大量的自由氨基處于非飽和狀態(tài)而不能充分反應;葡聚糖分子量較大，引起空間位阻較大，且反應基團少;當葡聚糖含量較多時，溶液粘度增大，同時由于大分子的空間穩(wěn)定作用，使得活性位點不易靠近［23］。所以合適的反應物配比不但可以促使反應快速充分的進行，還可以降低副反應（焦糖化等）的發(fā)生。由圖5可以看出，接枝度隨著兩者比值的變化呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，當兩者比值達到15∶1時，反應物之間反應基團的結(jié)合達到最佳狀態(tài)，接枝度達到最大，且褐變指數(shù)相對較低。

圖5 ε－聚賴氨酸/葡聚糖質(zhì)量比對反應的影響Fig.5 Effect of substrate ratio on graft and browning index

3 結(jié)論

本文研究了亞臨界水中蛋白質(zhì)多糖的美拉德反應，為實現(xiàn)蛋白質(zhì)－多糖共價復合物的快速制備提供了新的途徑。通過實驗表明，反應溫度、時間、pH、反應物配比對接枝度都有顯著的影響，而適當?shù)靥岣邏毫t可以減輕褐變的發(fā)生。同時研究了亞臨界水環(huán)境中各種因素對美拉德反應的影響，對于亞臨界水提取目標活性物質(zhì)過程中，抑制或促進美拉德反應同樣具有重要意義。

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Effect of different parameters on maillard reaction betweenε－polylysine and dextran under subcriticalwater environment

LIChun－lin，GAO Yan－xiang*，YUAN Fang，WANG Ying－ying，TAO Yi－di，ZHANG Xiao－fei

（College of Food Science＆Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

The effec ts of tem perature，p ressure，tim e，pH，substrate ratio under subc riticalwater environment on the maillard reaction betweenε－polylysine and dextran were researched.Degree of graft and browning index were introduced to evaluate the effects of different factors on the speed of maillard reaction.The results showed that b rowning index was positively correlated w ith tem perature，time and pH，but it was negatively correlated w ith p ressure.Deg ree of g raft increased first and then decreased under the effect of time，pH，substrate ratio.

subc riticalwater;maillard reac tion;deg ree of g raft;b rowning index

TS201.2

B

1002－0306（2012）02－0261－04

2011－03－23 *通訊聯(lián)系人

李春林（1987－），男，碩士研究生，研究方向:食品添加劑。

國家自然科學基金資助項目（31071609）。