熒光分析法測定肉類食品中諾氟沙星的殘留

蔡其洪，許桂芬，阮麗琴，李春來

（1.莆田學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，福建 莆田 351100；2.食品安全分析與檢測教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（福州大學(xué)），福建 福州 350108）

諾氟沙星（Norfloxacin，NFLX）又名氟哌酸，為第三代喹諾酮類抗菌藥物，具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)，毒副作用低和臨床療效高的特點(diǎn)，是臨床應(yīng)用最廣泛的喹諾酮類藥物之一.諾氟沙星系化學(xué)合成藥物，合成容易，價格低廉，故也是動物和水產(chǎn)養(yǎng)殖中最重要的抗感染藥物之一，然而由于濫用現(xiàn)象嚴(yán)重，導(dǎo)致藥物殘留，給食品安全帶來嚴(yán)重的威脅.該類藥物的殘留除其本身的毒副作用對人體造成直接危害外，更為嚴(yán)重的是人類長期食用含較低濃度藥物的動物源性食品，容易誘導(dǎo)人類致病菌產(chǎn)生耐藥性，從而影響該類藥物的臨床療效.

目前諾氟沙星的測定方法主要有紫外分光光度［1-2］，高效液相色譜法［3-5］，熒光分析法［6-8］.由于熒光法具有靈敏度高、選擇性好的特點(diǎn)，是應(yīng)用最廣泛的方法［9］.其中應(yīng)用Al3＋熒光增敏測定諾氟沙星，并用于滴眼液、膠囊［10］和牛奶［11］中諾氟沙星的測定.而熒光分析法用于肉類食品中諾氟沙星藥物殘留的檢測還未見文獻(xiàn)報道，且本文所建立的熒光法具有更低的檢出限（0.032ng·mL-1），特別適用于痕量藥物殘留的檢測，且樣品前處理方法簡單，用于實(shí)際肉類樣品中諾氟沙星含量的測定，所得結(jié)果令人滿意.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-4600熒光分光光度計(jì)（日本日立公司）；超聲清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；萬分之一電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠），PHS-3C酸度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器公司）.

諾氟沙星（中國藥品生物制品檢定所，99.2%），標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為100μg·mL-1，Al3＋標(biāo)準(zhǔn)溶液是用 Al（NO3）3（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）配成濃度為0.1mol·L-1，實(shí)驗(yàn)所需的各種肉類食品為市場上隨意購買，其他所用試劑均為分析純，水為純凈水.

1.2 樣品前處理方法

取2g經(jīng)絞碎的各種肉類食品，每次加入10 mL pH＝4的鹽酸溶液超聲提取三次，每次10 min，各離心10min（3 000r／min），合并三次上清液，加入1mL的Al3＋標(biāo)準(zhǔn)溶液，定容至50mL，待測.

1.3 測定方法

于5mL的具塞刻度試管中配制NFLX-Al3＋的最佳體系溶液，使體系溶液中CAl3＋＝2.0mmol·L-1、pH＝4.0，靜置5min，取試液置于1cm×1cm石英液池中，設(shè)置激發(fā)和發(fā)射單色儀狹縫寬度均為5nm，掃描速度為1 200nm·min-1，利用熒光分析法測定.

2 結(jié)果與討論

2.1 金屬離子的選擇

許多金屬離子可與諾氟沙星發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，使熒光強(qiáng)度發(fā)生變化.實(shí)驗(yàn)考察了Al3＋、Fe3＋、Fe2＋、Mg2＋、Zn2＋、Cu2＋和 Ni2＋等七種不同金屬離子與諾氟沙星配位反應(yīng)后熒光強(qiáng)度的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Al3＋、Fe2＋、Mg2＋和Zn2＋與諾氟沙星配位后熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，增強(qiáng)的順序?yàn)锳l3＋＞Zn2＋＞Fe2＋＞Mg2＋；而 Fe3＋、Cu2＋和 Ni2＋使諾氟沙星的熒光強(qiáng)度受到猝滅.因此，我們選擇Al3＋增強(qiáng)諾氟沙星的熒光強(qiáng)度作為分析測定的條件，其熒光光譜變化如圖1.

圖1 0.1μg·mL-1NFLX和NFLX-Al 3＋的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜Fig.1 Excitation and emission spectra of 0.1μg·mL-1 NFLX and NFLX-Al 3＋

2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)考察了NFLX-Al3＋反應(yīng)體系在24h內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化情況.結(jié)果可得從0～5min之內(nèi)，體系的熒光強(qiáng)度呈遞增狀態(tài)，從5min到24h之間，熒光強(qiáng)度的變化在3%以內(nèi)，因此實(shí)驗(yàn)選擇NFLX-Al3＋體系反應(yīng)5min后進(jìn)行分析測定.

2.3 pH值的影響

諾氟沙星結(jié)構(gòu)中的氧原子和氮原子在不同酸堿溶液中的質(zhì)子化程度不同，從而影響發(fā)光體系的電子性質(zhì)以及電子云分布，最后使NFLX-Al3＋體系的熒光性質(zhì)和強(qiáng)度發(fā)生變化.實(shí)驗(yàn)選擇用1.0mol·L-1鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)使NFLX-Al3＋體系中的pH＝0～14，考察在不同pH值溶液中熒光強(qiáng)度的變化，結(jié)果如圖2所示，當(dāng)溶液的pH＝4時，NFLX-Al3＋體系的熒光強(qiáng)度最大.

圖2 不同pH值溶液中體系熒光強(qiáng)度的變化Fig.2 Fluorescence intensity changes in different pH solutions

2.4 Al 3＋濃度的影響

實(shí)驗(yàn)選擇諾氟沙星與不同Al3＋濃度進(jìn)行反應(yīng)，測量其熒光強(qiáng)度的變化，結(jié)果可得當(dāng)Al3＋濃度達(dá)到2.0mmol·L-1時，體系的熒光強(qiáng)度最大且處于穩(wěn)定，見圖3.故實(shí)驗(yàn)選擇Al3＋濃度為2.0 mmol·L-1作為反應(yīng)的濃度.

圖3 不同Al 3＋濃度對體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 lnfluence of the concentration of Al 3＋ on relative fluorescence intensity of NFLX-Al 3＋

2.5 樣品背景干擾情況

肉類樣品的基體復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)考察了各種肉類樣品基體的干擾情況，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得空白肉類基體主要是內(nèi)源性蛋白質(zhì)的干擾，即內(nèi)源性蛋白質(zhì)有著較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，但在本實(shí)驗(yàn)選取的最佳條件下熒光峰位置λem＝433nm處測定時，內(nèi)源性蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度可以忽略不計(jì)，見圖4.

圖4 0.1μg·mL-1NFLX-Al 3＋（1-1′）和肉類食品（2-2′）的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜Fig.5 Excitation and emission spectra of 0.1μg·mL-1 NFLX-Al 3＋ （1-1′）and meat product（2-2′）

2.6 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和檢出限

梯度配制不同濃度的諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，熒光法分別測定每一種溶液的熒光強(qiáng)度，以λem＝433nm處的熒光強(qiáng)度對諾氟沙星的濃度作工作曲線，見圖5.得諾氟沙星的線性方程為F＝15.89＋36.50C，線性范圍為0.5～250ng·mL-1，相關(guān)系數(shù)R＝0.999 9，方法的檢出限為0.032ng·mL-1.

2.7 精密度實(shí)驗(yàn)

配制6份相同質(zhì)量濃度為10ng·mL-1的諾氟沙星溶液，在一定的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行熒光法測定，得諾氟沙星的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.3%.從實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果來看，該方法具有很好的精密度.

圖5 諾氟沙星的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.5 Calibration curves of norfloxacin

2.8 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

分別在不含有諾氟沙星的各種肉類食品中加入不同量的諾氟沙星，設(shè)定最佳實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測定，每一份樣品平行測定三次，結(jié)果取平均值，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)見表1所示.

表1 各種樣品中諾氟沙星的回收率Table 1 Recovery of norfloxacin in every samples

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)采用Al3＋與諾氟沙星配位增強(qiáng)熒光強(qiáng)度，建立了肉類中諾氟沙星藥物殘留的直接熒光分析法.樣品只需通過簡單的處理，不需要分離，即可用于復(fù)雜肉類基體中諾氟沙星藥物殘留的痕量測定，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有很好的準(zhǔn)確度、靈敏度和選擇性.

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