超聲波法輔助提取花生中輔酶Q10的工藝優(yōu)化

陶志杰，曹 迪，王改玲,*，孫蘭萍，錢(qián)時(shí)權(quán)，邵 杰，王 睿

(1.蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233030；2.蚌埠學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與環(huán)境工程系，安徽 蚌埠 233030；3.成都市青白江區(qū)農(nóng)村發(fā)展局，四川 成都 610300)

超聲波法輔助提取花生中輔酶Q10的工藝優(yōu)化

陶志杰1，曹 迪1，王改玲1,*，孫蘭萍2，錢(qián)時(shí)權(quán)1，邵 杰1，王 睿3

(1.蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233030；2.蚌埠學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與環(huán)境工程系，安徽 蚌埠 233030；3.成都市青白江區(qū)農(nóng)村發(fā)展局，四川 成都 610300)

以花生為原料，利用超聲波細(xì)胞破碎法正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取其中的輔酶Q10。結(jié)果表明，超聲功率為影響提取效果的極顯著因素，其次是超聲總時(shí)間和單次提取/間歇時(shí)間，水添加量影響最小。20g干燥后的粉碎花生中輔酶Q10最佳提取工藝條件為超聲總時(shí)間45min、超聲功率300W、單次工作/間歇時(shí)間7.5s/5.0s、水添加量400mL，在該工藝條件下輔酶Q10的最大提取量為461μg/g。

花生；輔酶Q10；超聲提??；正交試驗(yàn)

輔酶Q10(Coenzyme Q10，CoQ10)，化學(xué)名稱為2,3-二甲氧基-5-甲基-6-癸異戊烯基-苯醌，廣泛存在于生物體細(xì)胞線粒體中，因此又名泛醌。在細(xì)胞線粒體內(nèi)呼吸鏈質(zhì)子轉(zhuǎn)移及電子傳遞中起重要作用[1]，它作為一種良好的生化藥物和天然的抗氧化劑，在臨床醫(yī)藥、營(yíng)養(yǎng)保健品及化妝品等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[2]。目前，輔酶Q10的制備方法主要有4種：動(dòng)植物組織提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和植物細(xì)胞培養(yǎng)法[3]。

花生中富含多種降低膽固醇、有益心腦血管、抗衰老等的功能因子，包括白黎蘆醇，β-谷固醇、植物異黃酮和輔酶Q等[4-9]。據(jù)資料顯示花生是常見(jiàn)植物型食品中含量較為豐富的物種之一。提取細(xì)胞中活性物質(zhì)，細(xì)胞破碎效果是提高提取效率的關(guān)鍵步驟之一，直接影響著輔酶Q10的生物活性、提取量。本實(shí)驗(yàn)以花生果實(shí)為試驗(yàn)原料，采用超聲波細(xì)胞破碎技術(shù)輔助堿醇皂化法提取輔酶Q10，對(duì)超聲波的破碎細(xì)胞效果及其影響因素進(jìn)行研究，分析各因素對(duì)提取效果的影響并優(yōu)化了最佳提取條件，旨在為輔酶Q10的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅皮花生 安徽蚌埠市購(gòu)。無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、焦性沒(méi)食子酸、石油醚、無(wú)水硫酸鈉均為分析純。硼氫化鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

BS224S型電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；FW-100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；UH-500B型超聲波細(xì)胞粉碎儀 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；752紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 輔酶Q10的提取

將充分干燥過(guò)后的花生去紅皮用粉碎機(jī)粉碎，稱取約20g，加水在不同條件下進(jìn)行超聲破碎，然后將超聲過(guò)后的花生液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，再加入1.4g焦性沒(méi)食子酸，75mL 95%的乙醇，25mL蒸餾水，以及7.5g氫氧化鈉，在90℃條件下回流30min，過(guò)后迅速冷卻，加入石油醚，劇烈振蕩5min，萃取2次，取上清液合并，用去離子水洗至中性，再以無(wú)水硫酸鈉除去水分，減壓濃縮至干，加入10mL無(wú)水乙醇溶解，放入冰箱冷凍析出雜質(zhì)，過(guò)濾得濾液，待測(cè)[10]。

1.2.2 輔酶Q10的含量測(cè)定

將1.2.1節(jié)提取方法得到的待測(cè)液加入無(wú)水乙醇定容至25mL，以無(wú)水乙醇作空白對(duì)照，于波長(zhǎng)275nm處先測(cè)氧化型吸光度，然后于空白對(duì)照池和樣品池中分別加入0.1mL的0.1mol/L的新配制的硼氫化鈉溶液，待充分還原后，再于同一波長(zhǎng)處測(cè)還原型的吸光度[11-12]。計(jì)算輔酶Q10提取量。

式中：W為每克花生中輔酶Q10的含量/(μg/g)；A1為氧化型吸光度；A2為還原型吸光度；n為稀釋倍數(shù)；S為花生干質(zhì)量/g；142為輔酶Q10的質(zhì)量濃度為10g/L的無(wú)水乙醇溶液在275nm波長(zhǎng)下氧化型和還原型吸光度之差。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

稱取約20g干燥后的粉碎花生，在不同試驗(yàn)條件下進(jìn)行超聲波破碎，根據(jù)提取液中輔酶Q10提取量測(cè)定結(jié)果，對(duì)破碎細(xì)胞提取工藝中主要因素：1)超聲總時(shí)間；2)超聲功率；3)超聲單次工作/間歇時(shí)間；4)水添加量進(jìn)行分析。探討上述4個(gè)因素對(duì)輔酶Q10提取效果的影響。1.2.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行優(yōu)化提取試驗(yàn)[13]，因素水平見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲總時(shí)間對(duì)輔酶Q10提取量的影響

圖1 超聲波工作總時(shí)間對(duì)輔酶Q10提取量的影響Fig.1 Effect of total ultrasonic treatment time on the extraction of coenzyme Q10

由圖1可見(jiàn)，在輸出功率為300W，超聲單次工作/間歇時(shí)間5.0s/5.0s，水添加量為250mL的條件下，隨著超聲波工作總時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞破碎效果較好，輔酶Q10提取量增加，花生中輔酶Q10提取量達(dá)到最高值435μg/g。但是當(dāng)工作總時(shí)間超過(guò)45min以后，輔酶Q10提取量隨工作時(shí)間的延長(zhǎng)反而下降。分析其原因主要是因?yàn)橛捎谳o酶Q10對(duì)光敏感，易氧化分解。超聲波工作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使得輔酶Q10暴露自然光下并與氧氣接觸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致輔酶Q10降解。因此，適當(dāng)延長(zhǎng)超聲工作時(shí)間可提高輔酶Q10提取量，但是時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，最佳提取工作總時(shí)間為45min。

2.2 超聲波輸出功率對(duì)輔酶Q10提取量的影響

圖2 超聲波輸出功率對(duì)輔酶Q10提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the extraction of coenzyme Q10

在工作總時(shí)間為45min，超聲單次工作/間歇時(shí)間5.0s/5.0s，水添加量為250mL的條件下，超聲波輸出功率對(duì)輔酶Q10提取有較大影響，見(jiàn)圖2。輸出功率過(guò)小，使得細(xì)胞破碎不完全，輔酶Q10提取量偏低。而輸出功率過(guò)大，細(xì)胞液中空化作用造成的高溫高壓產(chǎn)生了H·和·OH等自由基[14]，這些強(qiáng)氧化型自由基使得輔酶Q10易發(fā)生氧化，從而導(dǎo)致輔酶Q10提取量下降。因此，應(yīng)控制超聲波輸出功率在300W最佳。

2.3 超聲單次工作/間歇時(shí)間對(duì)輔酶Q10提取量的影響

圖3 超聲波單次工作時(shí)間對(duì)輔酶Q10提取量的影響Fig.3 Effect of single working time/intermittent time on the extraction of coenzyme Q10

由圖3可知，在輸出功率為300W，工作總時(shí)間45min，水添加量為250mL的條件下，單次工作時(shí)間在5.0s～7.5s時(shí)提取效果較好。當(dāng)單次工作時(shí)間低于2.5s時(shí)，由于輻射時(shí)間太短，超聲波空化效應(yīng)不能發(fā)揮極致導(dǎo)致破碎效果差。但是當(dāng)單次工作時(shí)間超過(guò)7.5s后，超聲空化效應(yīng)強(qiáng)破碎好，但同時(shí)會(huì)產(chǎn)生較多活性氧而引起輔酶Q10含量下降。因此，最佳的單次超聲時(shí)間/間歇時(shí)間為5.0s/5.0s～7.5s/5.0s。

2.4 水添加量對(duì)輔酶Q10提取量的影響

提取時(shí)間為45min，超聲波功率300W，超聲單次工作/間歇時(shí)間7.5s/5.0s，不同水添加量對(duì)花生輔酶Q10提取量的影響如圖4所示。

圖4 水添加量對(duì)輔酶Q10提取量的影響Fig.4 Effect of water amount of the extraction of coenzyme Q10

由圖4可知，隨著水添加量的增大，輔酶Q10提取量逐漸增大，水添加量在100～200mL的范圍內(nèi)，輔酶Q10提取量增長(zhǎng)較快，這是因?yàn)殡S著細(xì)胞濃度的下降，降低了液體的黏稠度，提高了細(xì)胞在水中的分散度，從而提高了空化作用爆破的效果[15]。而水添加量在300～500mL時(shí)，細(xì)胞破碎效果隨水添加量增加而變差，同時(shí)對(duì)破碎后再次旋蒸濃縮細(xì)胞破碎液過(guò)大的體積而增加了提取操作時(shí)間，從而影響了輔酶Q10提取量。因此選擇最佳的水添加量為300mL。

2.5 輔酶Q10提取工藝優(yōu)化

2.5.1 正交試驗(yàn)

超聲波破碎法提取花生中輔酶Q10的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表 2 超聲波法輔助提取花生中輔酶Q10工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and corresponding results

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis for the experimental results of orthogonal array design

由表2、3可知，超聲波提取法的這4個(gè)因素中，影響最為顯著的因素是超聲輸出功率，其次是超聲波工作總時(shí)間和單次工作/間歇時(shí)間，水添加量影響最小。各因素對(duì)輔酶Q10提取量的影響程度依次為輸出功率＞工作總時(shí)間＞單次工作時(shí)間＞水添加量。綜合各因子的k值比較可得到A2B2C3D3為最佳提取條件，即工作總時(shí)間45min、輸出功率300W、單次工作/間歇時(shí)間7.5s/5.0s、水添加量為400mL。

2.5.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取5份同等條件干燥過(guò)后的粉碎花生各20g，按照正交試驗(yàn)最佳超聲破碎工藝提取并測(cè)定，測(cè)得花生中輔酶Q10平均提取量為461μg/g，RSD＝1.14%，結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可行。

2.6 超聲波輔助提取與常規(guī)提取效果比較

取質(zhì)量相同的干花生粉碎物，分別以超聲堿醇皂化法(優(yōu)化方案)和常規(guī)堿醇皂化法[5]處理，并按1.2.1節(jié)所示進(jìn)行提取，結(jié)果見(jiàn)圖5。兩種方法提取輔酶Q10的平均提取量分別為458μg/g和213μg/g，結(jié)果顯示超聲波法輔助提取效果更佳，輔酶Q10平均得率是常規(guī)法的2.2倍。該法操作簡(jiǎn)便，細(xì)胞破碎效果好，效率高。

圖5 兩種方法提取輔酶Q10提取量比較Fig.5 Comparison of extraction efficiencies of coenzyme Q10 by ultrasonic-assisted extraction and alkaline-alcohol saponification

3 結(jié) 論

3.1 通過(guò)正交試驗(yàn)，得到超聲波法提取20g干燥后粉碎花生果實(shí)中的輔酶Q10的最佳工藝參數(shù)為超聲總時(shí)間45min、超聲功率300W、單次工作/間歇時(shí)間7.5s/5.0s、水添加量400mL。在此條件下輔酶Q10的提取量為461μg/g。

3.2 超聲波輔助提取法與常規(guī)提取法相比，具有提取效果好，操作簡(jiǎn)便，節(jié)約原料等優(yōu)點(diǎn)。

3.3 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)萃取分離過(guò)程中一定要在避光黑暗環(huán)境下靜置較長(zhǎng)時(shí)間，直至上層黃色液體比較清明，若靜置不充分會(huì)影響提取量及提取純度。提取實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間在不太影響提取量的前體下，盡量選擇較短的處理時(shí)間，防止輔酶Q10在自然光下暴露而分解。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction Process for CoQ10from Peanuts

TAO Zhi-jie1，CAO Di1，WANG Gai-ling1,*，SUN Lan-ping2，QIAN Shi-quan1，SHAO Jie1，WANG Rui3
(1. Department of Biology and Food Engineering, Bengbu College, Bengbu 233030, China；2. Department of Applied Chemistry and Environment Engineering, Bengbu College, Bengbu 233030, China；3. Qingbaijiang District Village Development Bureau of Chengdu City, Chengdu 610300, China)

This study was undertaken to optimize the ultrasonic-assisted extraction of CoQ10 from peanuts using orthogonal array design. Ultrasonic power was identified as the most important factor affecting extraction efficiency, followed by total ultrasonic treatment time and single working time/intermittent time; and water amount had the smallest effect on extraction efficiency. The optimal process conditions for extracting CoQ10 from 20 g of dried peanuts were determined as total ultrasonic treatment time of 45 min, ultrasonic power of 300 W, working/intermittent time of 7.5 s/5.0 s and water amount of 400 mL. The extraction yield of coenzyme Q10 reached up to 461 μg/g under these conditions.

peanut；CoQ10；ultrasonic-assisted extraction；orthogonal array design

Q814.1

A

1002-6630(2012)18-0053-04

2011-07-22

蚌埠學(xué)院院級(jí)科研項(xiàng)目(2010ZR17)

陶志杰(1979—)，女，講師，碩士，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)提取與制備。E-mail：tz584@163.com

*通信作者：王改玲(1979—)，女，講師，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)。E-mail：gailingwang@163.com