響應(yīng)面分析法優(yōu)化回流提取岷江柏總黃酮工藝

王文蘭，楊 梅，嚴 平，王曉玲*

(西南民族大學少數(shù)民族藥物研究所，四川 成都 610041)

響應(yīng)面分析法優(yōu)化回流提取岷江柏總黃酮工藝

王文蘭，楊 梅，嚴 平，王曉玲*

(西南民族大學少數(shù)民族藥物研究所，四川 成都 610041)

目的：優(yōu)化岷江柏總黃酮的回流提取工藝。方法：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，通過回歸分析各工藝參數(shù)與響應(yīng)值之間的關(guān)系，優(yōu)化岷江柏總黃酮最佳提取工藝條件。結(jié)果：最佳工藝條件為回流溫度90℃、乙醇體積分數(shù)70%、浸泡時間37min，其他條件為回流時間70min、液料比40:1(mL/g)、提取次數(shù)3次，在最佳工藝條件下提取率可達7.211%。結(jié)論：響應(yīng)面分析法優(yōu)化回流提取總黃酮的預(yù)測準確、方便，所得的最佳提取工藝高效、可行。

響應(yīng)面法；岷江柏；總黃酮；回流提取

岷江柏(Cupressus chengjanaS.Y.Hu)為柏科柏木屬常綠喬木，分布于四川岷江流域的汶川、理縣、大渡河流域的馬爾康等地[1]，主要用于園林裝飾，其葉中較多的揮發(fā)油用作香精的原料。柏科植物根、莖、葉、枝均可入藥，具有重要的經(jīng)濟和藥用價值，其主要化學成分為揮發(fā)油、黃酮類、生物堿類、酚酸類、有機酸等[2-10]。本課題組通過預(yù)實驗對岷江柏化學成分進行定性分析，發(fā)現(xiàn)其含有大量黃酮類成分，后經(jīng)系統(tǒng)分離，得到化合物槲皮苷[11]。該屬植物中的總黃酮成分具有高效低毒的優(yōu)勢，具有多種生物活性如抗腫瘤、抗氧化、止血、鎮(zhèn)咳祛痰、抑制核苷運轉(zhuǎn)、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和神經(jīng)等，廣泛用于醫(yī)藥、食品等行業(yè)，具有廣泛的開發(fā)應(yīng)用前景[12-18]。

目前尚未有關(guān)于岷江柏總黃酮提取工藝研究的報道，為進一步研究開發(fā)該植物，本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法系統(tǒng)優(yōu)化其提取工藝，為促進該植物的有效開發(fā)利用和進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

岷江柏植物藥材2009年8月采集于四川小金縣，經(jīng)西南民族大學劉園教授鑒定為柏科柏木屬植物岷江柏(Cupressus chengjanaS.Y.Hu)。槲皮苷由本實驗室制備，其結(jié)構(gòu)經(jīng)質(zhì)譜、紫外、紅外、核磁共振譜等波譜進行表征，純度大于99.5%；其余試劑均為國產(chǎn)分析純；實驗用水均為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1901紫外分光光度計 北京普析通用儀器公司；AE 240型電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；Senconw 201-恒溫水浴鍋 上海申生科技公司。

1.3 方法

1.3.1 總黃酮的提取工藝流程

岷江柏枝葉→50℃烘干→粉碎→乙醇溶液浸泡→回流提取→抽濾→濾液濃縮→岷江柏總黃酮提取物

1.3.2 標準曲線的制作

精密稱取真空干燥至質(zhì)量恒定的槲皮苷標準品35.0mg，置100mL容量瓶中，用無水乙醇溶解，定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度0.35mg/mL的對照品溶液。分別精密量取0.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL的槲皮苷標準品溶液(0.35mg/mL)，置于50mL容量瓶中，加入無水乙醇9mL，振搖溶解，靜置5min；再加入5% NaNO2溶液5mL，振搖，靜置6min，加入10% Al(NO3)3溶液5mL，振搖，靜置6min，最后加入5% NaOH溶液20mL，振蕩搖勻，靜置15min。用無水乙醇定容至刻度。以沒加入槲皮苷且按照上述相同顯色方法配制的乙醇溶液為空白溶液。在500nm波長處測定吸光度A，以A(y)為橫坐標、槲皮苷的含量(x，mg/mL)為縱坐標作線性回歸，得標準曲線：y＝12.923x－0.0048，r＝0.9994。結(jié)果表明槲皮苷質(zhì)量濃度在0.017～0.040mg/mL之間線性關(guān)系良好，滿足含量測定要求。

1.3.3 岷江柏總黃酮的提取率測定

精密稱取岷江柏干粉1.000g置于50mL圓底燒瓶中，加入一定液料比、一定體積分數(shù)乙醇，使藥材浸泡一定時間后，在一定溫度下回流一定時間，一定提取次數(shù)，過濾，合并濾液，濃縮，無水乙醇定容至100mL容量瓶，精密吸取5.00mL提取液，按照1.3.2節(jié)方法進行顯色并測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算出總黃酮的質(zhì)量，計算總黃酮提取率。

1.3.4 岷江柏總黃酮提取工藝優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗

準確稱取岷江柏干粉1.000g置于50mL圓底燒瓶中，在其他條件相同的情況下，采用不同液料比、乙醇體積分數(shù)、浸泡時間、回流溫度、回流時間、提取次數(shù)進行回流提取，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，考察各單因素對提取效果的影響。

1.3.4.2 響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取影響總黃酮提取率顯著的回流溫度、乙醇體積分數(shù)、浸泡時間3個因素為考察對象，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，通過Design-Expert 7.1.6軟件，采用Box-Behnken設(shè)計試驗對3個主要影響因素進行優(yōu)化，建立回歸模型，確定最佳提取工藝，因素水平設(shè)計見表1。

表1 岷江柏總黃酮提取響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果及分析

2.1.1 液料比對總黃酮提取的影響

精密稱取岷江柏干粉1.000g，用60%乙醇浸泡45min后，回流溫度80℃，回流70min，提取3次，液料比分別為10:1、20:1、30:1、40:1、50:1(mL/g)五個水平，測定總黃酮提取率。

圖1 液料比對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on extraction rate of total flavonoids

圖1顯示，當液料比小于40:1時，隨著液料比的增大提取率呈上升趨勢，并且在液料比40:1時，其提取率達到最大，但是隨著液料比的增大提取率反而呈下降趨勢。其原因在于液料比影響溶劑的極性，從而影響不同極性黃酮類的溶解性；當液料比增大時，乙醇中提取出的總黃酮濃度相對較小，傳質(zhì)阻力較小，利于原藥中黃酮類化合物的溶出，但是液料比太大，在較長的后續(xù)處理加熱過程中對熱不穩(wěn)定的黃酮可能被氧化分解等，從而提取率降低。因此液料比選擇在40:1左右為宜，在響應(yīng)面試驗中不做考察。

2.1.2 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取的影響

精密稱取岷江柏干粉1.000g，固定液料比40:1，用一定體積分數(shù)乙醇浸泡45min，回流溫度80℃，回流70min，提取3次，乙醇體積分數(shù)分別為45%、60%、75%、80%、95%，測定總黃酮提取率。

圖2 乙醇體積分數(shù)對提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids

由圖2可知，隨著乙醇體積分數(shù)增加，岷江柏總黃酮提取率逐步上升，其原因可能是在水中溶解度小的黃酮，比如：槲皮苷，柏黃酮等在醇中溶解度大；當乙醇體積分數(shù)增大到60%時，提取率最大，此時醇溶性黃酮基本提取完畢，達到動態(tài)平衡；當乙醇體積分數(shù)增加到75%以后，提取率反而下降，其原因可能是岷江柏總黃酮中水溶性黃酮較多，所以醇濃度增加，水含量減少，使得水溶性黃酮的提取率下降。因此乙醇體積分數(shù)考察范圍在60%～75%之間為宜。

2.1.3 浸泡時間對總黃酮提取的影響

精密稱取岷江柏干粉1.000g，固定液料比40:1，用60%乙醇浸泡一定時間，回流溫度80℃，回流70min，提取3次，分別浸泡15、30、45、60、75min，測定總黃酮提取率。

圖3 浸泡時間對提取率的影響Fig.3 Effect of soaking time on extraction rate of total flavonoids

由圖3可知，隨著浸泡時間的延長，岷江柏中總黃酮的提取率增加，在30～45min區(qū)間內(nèi)總黃酮提取率較高，但超過45min以后，總黃酮的增加量減少，可能是浸泡時間增加，浸泡出大量雜質(zhì)，從而影響總黃酮的含量。因此浸泡時間選在30～45min為宜。

2.1.4 回流溫度對總黃酮提取的影響

精密稱取岷江柏干粉1.000g，固定液料比40:1，用60%乙醇浸泡45min后，回流70min，提取3次，回流溫度分別用60、70、80、90、100℃五個水平，測定總黃酮提取率。

圖4 回流溫度對提取率的影響Fig.4 Effect of reflux temperature on extraction rate of total flavonoids

由圖4可知，當回流溫度在60～80℃時，岷江柏中總黃酮的提取率增加，當溫度繼續(xù)增加到90～100℃時，其總黃酮的提取率反而降低。其原因可能是總黃酮在一定適宜的溫度下提取率增加，當過大的溫度會促使一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強的成分溶出量增加，與黃酮類化合物競爭和乙醇、水結(jié)合，從而導致黃酮類化合物提取率下降，影響總黃酮的提取率。因此回流溫度取80～90℃為宜。

2.1.5 回流時間對總黃酮提取的影響

精密稱取岷江柏干粉1.000g，固定液料比40:1，用60%乙醇浸泡45min后，回流溫度80℃，回流提取3次，回流時間分別為30、50、70、90、110min，測定總黃酮提取率。

圖5 回流時間對提取率的影響Fig.5 Effect of reflux time on extraction rate of total flavonoids

由圖5可知，總黃酮提取率隨著回流時間的延長而不斷增加，但在70min過后，隨著時間的延長，其提取率稍有下降。其原因在于：由于提取包括擴散、滲透和溶解等過程，時間延長有助于黃酮類化合物的溶出，從而提取率上升，故提取時間越長，提取越完全，70min以后黃酮提取基本完全，隨著時間的延長黃酮提取率變化不大。

2.1.6 提取次數(shù)對總黃酮提取的影響

精密稱取岷江柏干粉1.000g，固定液料比40:1，用60%乙醇浸泡45min后，回流溫度80℃，回流7 0 mi n，分別提取1、2、3、4、5次，測定總黃酮提取率。

圖6 提取次數(shù)對提取率的影響Fig.6 Effect of repeated extraction number on extraction rate of total flavonoids

由圖6可知，隨著提取次數(shù)的增加，岷江柏中總黃酮的提取率增加，提取次數(shù)越多總黃酮的提取率越高，但超過3次以后，總黃酮的增加量減少。因此提取次數(shù)選在3次為宜，在響應(yīng)面試驗中不做考察。

2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計

表2 岷江柏總黃酮提取工藝響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果表2，利用Design-Expert 7.1.6對表2數(shù)據(jù)(響應(yīng)值)進行多元回歸擬合及對模型進行方差分析，結(jié)果見表3。各因素經(jīng)二次多項回歸擬合后，得到岷江柏總黃酮提取率對回流溫度、乙醇體積分數(shù)、浸泡時間3個因素的二次多項回歸方程：0

表3 回歸方程各項方差分析Table 3 Analysis of variance for each term of the fitted regression equation

經(jīng)方差分析得到：模型的F值為11.30、P值為0.0021＜0.05，說明本實驗所采用的二次模型是顯著的。PA、均小于0.01，達到極顯著水平，但乙醇體積分數(shù)、浸泡時間及其二次項、相互項都不顯著，說明各因素間的交互作用很小。決定因素R2為0.9356，也說明模型能夠很好的反應(yīng)響應(yīng)值的變化，擬合度好。由方差分析結(jié)果可知，回流溫度、乙醇體積分數(shù)、浸泡時間3個因素在試驗過程中均起主要作用，對總黃酮提取率的影響順序為回流溫度＞乙醇體積分數(shù)＞浸泡時間。

2.3 響應(yīng)面分析

圖7 各兩因素交互作用對岷江柏總黃酮提取率影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effects of three variables on extraction rate of total flavonoids

由圖7可知，回流溫度是影響總黃酮提取率的最主要因素，乙醇體積分數(shù)次之，選擇合適的回流溫度和乙醇體積分數(shù)，可獲得較高的提取率。由圖7a可以看出，當回流溫度不變時，總黃酮提取率隨著乙醇體積分數(shù)的升高而先增加后降低，并在0水平左右達到最大值；而當乙醇體積分數(shù)不變時，總黃酮提取率隨著回流溫度的升高而升高；由圖7b可以看出，當回流溫度不變時，總黃酮提取率隨著浸泡時間的延長而先升高后降低，曲面趨于平緩；當浸泡時間不變時，總黃酮提取率隨著回流溫度的升高而升高。由圖7c可以看出，乙醇體積分數(shù)不變時，總黃酮提取率隨著浸泡時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并在0水平左右達到最大值；當浸泡時間不變時，總總黃酮提取率隨著乙醇體積分數(shù)的升高也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并由圖分析得到，在乙醇體積分數(shù)和浸泡時間均達到0水平附近總總黃酮提取率可達到最大值。

通過最優(yōu)化分析，最佳的提取條件為回流溫度90℃、乙醇體積分數(shù)69.34%、浸泡時間36.91min、回流時間70min、液料比40:1、提取次數(shù)3次，預(yù)測提取率為7.229%，但考慮到實際操作的局限性，將提取工藝修正為回流溫度90℃、乙醇體積分數(shù)70%、浸泡時間37min、回流時間70min、液料比40:1、提取次數(shù)3次，在此條件下，驗證實驗得到總黃酮的提取率為7.211%，與預(yù)測值基本相符，證實了該方程的準確性和實用性。

3 結(jié) 論

采用回流方法對岷江柏總黃酮進行提取，通過單因素試驗和Box-Behnken試驗設(shè)計以及響應(yīng)面分析法對岷江柏總黃酮的提取工藝條件進行優(yōu)化，通過回歸分析建立相關(guān)性良好的方程，得到最佳的提取工藝為回流溫度90℃、乙醇體積分數(shù)70%、浸泡時間37min、回流時間70min、液料比40:1、提取次數(shù)3次，并在此條件下總黃酮提取率為7.211%。得到的岷江柏總黃酮提取率與各影響因素變量的二次方程模型，該模型回歸極顯著，對試驗擬合較好。

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Optimization of Reflux Extraction Process for Total Flavonoids fromCupressus chengjanaS. Y. Hu by Response Surface Methodology

WANG Wen-lan，YANG Mei，YAN Ping，WANG Xiao-ling*
(Ethnic Pharmaceutical Institute, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China)

Objective: To optimize the reflux extraction of total flavonoids from leaves and stems ofCupressus chengjanaS. Y. Hu. Methods: One-factor-at-a-time design and response surface methodology (RSM) were used to determine optimal conditions for the extraction of total flavonoids through regression analysis of the relationship between the extraction efficiency of total flavonoids and various process parameters. Results: The optimal extraction process was soaking for 37 min in 70% ethanol solution at a solid-to-solvent ration of 1:40 (g/mL) followed by reflux extraction repeated 3 times for 70 min each time, resulting in an extraction efficiency of 7.211%. Conclusion: Response surface methodology can provide an accurate and convenient way to predict the reflux extraction of total flavonoids to obtain optimal process with high effectiveness and applicability.

response surface methodology (RSM)；Cupressus chengjanaS. Y. Hu；total flavonoids；reflux extraction

TQ461

A

1002-6630(2012)18-0057-06

2011-07-11

西南民族大學中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費項目(11NFW02)；西南民族大學2012年研究生學位點建設(shè)項目(2012XWD-S0703)

王文蘭(1988—)，女，碩士研究生，研究方向為天然藥物化學。E-mail：ningxiatongxin@126.com

*通信作者：王曉玲(1969—)，女，教授，博士，研究方向為天然藥物化學。E-mail：wxl3232@sina.com