大孔樹脂法純化玉竹總皂苷的工藝研究

王曉林，李 珍，鐘方麗*

(吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院， 吉林 吉林 132022)

大孔樹脂法純化玉竹總皂苷的工藝研究

王曉林，李 珍，鐘方麗*

(吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院， 吉林 吉林 132022)

目的：篩選出分離、純化玉竹總皂苷的大孔樹脂型號及工藝條件。方法：通過靜態(tài)吸附與解吸實驗確定大孔樹脂的型號。在靜態(tài)吸附與解吸單因素試驗基礎(chǔ)上，利用四因素四水平正交試驗對LSA-33型大孔樹脂純化玉竹總皂苷的工藝進行研究，以總皂苷吸附率、解吸率為指標，確定最佳工藝。結(jié)果：LSA-33型樹脂對玉竹總皂苷具有較好的純化效果，其最佳工藝為：pH6～7的玉竹提取液，樹脂吸附4h，解吸液為體積分數(shù)95%的乙醇，解吸液用量與樹脂質(zhì)量比37.5:1(mL/g)，解吸時間為2h時，玉竹浸膏中總皂苷的含量由未純化前的12.28%提高到41.75%。結(jié)論：LSA-33型大孔樹脂可較好地純化玉竹總皂苷，且操作簡單、安全、成本低廉，有較高的應(yīng)用價值。

玉竹；總皂苷；大孔吸附樹脂； 純化

玉竹(Rhizoma Polygonati Odorati)為百合科(Liliaceae)植物玉竹的干燥根莖，性平，味甘，具有養(yǎng)陰潤燥、生津止渴的功能，用于熱病口燥咽干、干咳少痰、心煩心悸、糖尿病等[1]，廣泛分布于東北、華北、華東及湖北、湖南、廣東等地，喜陰濕環(huán)境，較耐寒，在山區(qū)和平壩都可栽培[2]。從玉竹中已經(jīng)分離鑒定了甾體皂苷、黃酮、生物堿、多糖、甾醇、鞣質(zhì)、黏液質(zhì)和強心苷等多類成分[3]，玉竹多糖能夠降低糖尿病小鼠的血糖、血脂水平[4]，玉竹總黃酮能清除二苯基苦味肼基(DPPH)自由基，能增強衰老模型小鼠血液中SOD活性，降低肝組織中MDA含量[5]。甾體皂苷是玉竹的活性成分之一，具有降血糖、降血脂、抗菌消炎作用[6]。藥理研究表明，玉竹還有強心、擴張血管、降血壓、抗腫瘤和增強免疫功能等作用[7]。由于玉竹具有藥食兩用功能，在市場上已經(jīng)出現(xiàn)了很多保健食品與保健飲料，如玉竹茶、玉竹面條、玉竹飲料、玉竹果圃等，在我國廣東、廣西及香港、新加坡、東南亞等國家民間還用于煲湯，保健效果良好。已有研究發(fā)現(xiàn)，用大孔吸附樹脂富集、純化黃芪、仙茅、人參等總皂苷，效果較理想[8-10]，而有關(guān)玉竹總皂苷純化工藝的研究尚未見報道。本實驗針對6種不同型號的大孔樹脂進行了純化玉竹總皂苷的篩選，并通過靜態(tài)實驗對LSA-33型大孔樹脂純化玉竹總皂苷的工藝條件進行優(yōu)化，從而為生產(chǎn)中更有效利用玉竹總皂苷、發(fā)揮其最大經(jīng)濟效益提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薯蕷皂苷元對照品 中國藥品生物制品檢定所；玉竹 安徽省亳州市華申藥業(yè)有限公司；水為重蒸餾水；大孔樹脂(LSA-21、LSA-10、AB-8、LX-36、D-101、LSA-33) 西安藍曉科技有限公司；無水乙醇、甲醇、硫酸、石油醚等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MAS-Ⅱ超聲波提取儀 濟寧金百特電子有限公司；752N型紫外可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZD型循環(huán)水真空泵 河南省鞏義市英峪儀器一廠；CS101-AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱 中國重慶實驗設(shè)備廠；JY2002型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總皂苷含量測定

1.3.1.1 標準曲線的制備

精密稱取薯蕷皂苷元對照品1.50mg，置于100mL容量瓶中，加入無水甲醇溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度0.015mg/mL的薯蕷皂苷元對照品溶液。精密量取薯蕷皂苷元對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL分別置于6個10mL具塞試管中，水浴揮干無水甲醇，加入濃硫酸溶液(1mol/L)10.0mL，置于50℃水浴保溫30min，冷卻4min，以相應(yīng)試劑為空白，在410nm波長處測吸光度。以質(zhì)量濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線，進行直線回歸[11]，得回歸方程：A＝0.04199C＋0.01078，R＝0.9994，表明薯蕷皂苷元在0.75～12.00μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

1.3.1.2 樣品含量測定

取樣品液、吸附后液及解吸液各適量，置于10mL具塞試管中，按1.3.1.1節(jié)方法，于410nm波長處測定吸光度，以不加供試品的平行樣為空白。從標準曲線上計算出供試品溶液中薯蕷皂苷元的質(zhì)量濃度，供試品中總皂苷的量以薯蕷皂苷元計算。

1.3.2 大孔吸附樹脂的預(yù)處理

取大孔吸附樹脂LX-36、LSA-33、LSA-10、D-101、AB-8、LSA-21各50.0g加入柱內(nèi)，先以95%乙醇連續(xù)洗滌數(shù)次約2h，至流出液加水(1:5)不混濁為止，后用蒸餾水洗至無醇味，然后用5% HCl溶液浸泡4h后以4～6BV/h的流速洗滌2h，再用蒸餾水洗至中性，最后用2% NaOH溶液浸泡6h后以4～6BV/h洗滌2h，再用蒸餾水洗至中性，抽濾至干，置于密閉容器中，備用[12]。

1.3.3 玉竹總皂苷樣品液的制備

稱取干燥玉竹50.0g于250mL圓底燒瓶中，加入50%乙醇溶液150mL超聲提取3次，每次30min，過濾，合并以上3次濾液，蒸干，加入100mL的無水甲醇超聲溶解，然后加入100mL 15%硫酸溶液回流2h，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，用石油醚萃取3次，每次100mL，合并石油醚萃取液，將石油醚萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘渣用90%乙醇溶液溶解，過濾，濾液用90%乙醇溶液定容至250mL容量瓶中，待用。

1.3.4 大孔吸附樹脂的選擇

6種大孔吸附樹脂的物理性能見表1。取處理后樹脂LX-36、LSA-33、LSA-10、D-101、AB-8、LSA-21各2.0g，加入到100mL具塞三角瓶中，加入30mL質(zhì)量濃度0.1368mg/mL的玉竹總皂苷溶液[13]，每10min振搖1次，約30s，共2h，靜止48h，濾過。分別吸取各樹脂吸附后的溶液1.0mL，在410nm波長處測定吸光度(A)，計算各樹脂對玉竹總皂苷的吸附率，將靜態(tài)吸附的樹脂抽濾至干，室溫條件下，加入100mL95%乙醇溶液解吸，每10min振搖1次，約30s，持續(xù)2h，靜置48h，過濾。分別取各解吸液1.0mL，于410 nm處測定吸光度(A)，計算各種樹脂對玉竹總皂苷的解吸率。各指標的計算公式如下[14]：

表1 6種大孔樹脂的物理性能Table 1 Physical properties of 6 types of macroporous adsorption resin

式中：C0為起始樣品液中總皂苷質(zhì)量濃度/(mg/mL)；C1為吸附48h后溶液中總皂苷質(zhì)量濃度/(mg/mL)；C2為解吸液中總皂苷質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V1為樣品液體積/mL；V2為解吸液體積/mL；m1為解吸液干燥后固體的稱樣量/ mg；m2為解吸液中總皂苷的測定量/mg。

1.3.5 大孔吸附樹脂純化玉竹總皂苷最佳條件的確定

1.3.5.1 靜態(tài)吸附和解吸單因素試驗

(1) 吸附時間的確定

選取LSA-33型大孔樹脂進行操作，操作步驟同1.3.4節(jié)至解吸前步驟，分別振蕩吸附1、2、3、4、5、6、7、8 h，測定溶液中總皂苷質(zhì)量濃度，計算吸附率。

(2) 解吸液解吸液體積分數(shù)的確定

選取LSA-33型大孔樹脂進行操作，解吸時乙醇體積為50mL，其余操作步驟同1.3.4節(jié)，體積分數(shù)分別為10%、30%、50%、70%、90%，計算解吸率。

(3) 解吸液乙醇用量的確定

選取LSA-33型大孔樹脂進行操作，玉竹總皂苷溶液質(zhì)量濃度為0.1365mg/mL，其余操作步驟同1.3.4節(jié)，解吸時乙醇體積分別為20、30、40、50、60、70、80mL，過濾后的解吸液分別移取0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2mL于7個具塞試管中，測定溶液中總皂苷的質(zhì)量濃度，計算解吸率。

(4) 解吸時間的確定

選取LSA-33型大孔樹脂進行操作，玉竹總皂苷溶液質(zhì)量濃度為0.1375mg/mL，其余操作步驟同1.3.4節(jié)，解吸時乙醇體積為70mL，解吸時間分別為1、1.5、2、2.5、3 h，計算解吸率。

(5) 吸附液pH值的確定

選取LSA-33型大孔樹脂進行操作，玉竹總皂苷溶液質(zhì)量濃度為0.1358mg/mL，其余操作步驟同1.3.4節(jié)至解吸前步驟，分別用5%鹽酸溶液和5% NaOH溶液調(diào)p H值為4、5、6、7、8、9，計算吸附率。

1.3.5.2 正交試驗

通過單因素試驗可知，玉竹總皂苷樣品液的pH值為6～7時，吸附率較高且比較穩(wěn)定，在此基礎(chǔ)上，固定玉竹總皂苷樣品液的pH值為6～7，選擇吸附時間、解吸液乙醇體積、解吸液體積分數(shù)、解吸時間為考察因素進入正交試驗進一步優(yōu)化工藝。以解吸率為考察指標，確定大孔樹脂純化玉竹總皂苷的最佳條件。正交試驗因素水平表如表2所示。所有試驗中，每次試驗取用的LSA-33型大孔樹脂為2.0g。

表2 正交試驗設(shè)計因素水平表Table 2 Factors and their levels for orthogonal array design

1.3.6 工藝驗證實驗

選取LSA-33型大孔樹脂進行操作，操作步驟同1.3.4節(jié)，玉竹總皂苷溶液質(zhì)量濃度為0.1375mg/mL，調(diào)節(jié)pH值為6～7，解吸時乙醇溶液的體積分數(shù)和體積分別為95%和75mL，計算解吸率。

1.3.7 浸膏中總皂苷含量的測定

稱取LSA-33型大孔樹脂6.0g，共稱取3份，分別置于3個干燥250mL三角瓶中，同時分別取90mL供試品溶液(總皂苷質(zhì)量濃度為0.1375mg/mL)于250mL三角瓶內(nèi)，振蕩吸附4h，每10min振搖1次，每次振搖30s，分別過濾。然后向過濾后帶有樹脂的3個三角瓶中各加入225mL 95%乙醇溶液，振蕩解吸2h，每10min振搖1次，每次振搖3 0 s，過濾，過濾后的解吸液各取1.0mL于3個具塞試管中，按照1.3.1節(jié)的方法測定溶液中總皂苷的含量。再取90mL總皂苷質(zhì)量濃度為0.1375mg/mL的玉竹總皂苷樣品液、上述解吸液220mL倒入稱質(zhì)量后的蒸發(fā)皿中水浴蒸干，基本蒸干后放入溫度調(diào)為60℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥，待其干燥至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量后得差值，得浸膏質(zhì)量，計算總皂苷的純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹脂的選擇

6種不同型號的樹脂在相同條件下，經(jīng)過48h靜態(tài)吸附及解吸，分別計算出其對玉竹總皂苷的靜態(tài)吸附率和解吸率，結(jié)果如表3所示。

從表3可以看出，LSA-33型樹脂的吸附率最高，D-101型樹脂的吸附率最低；從解吸率角度看，D-101型樹脂的解吸率最高，達到了95.27%，但吸附率只有36.07%，解吸率僅低于D-101型樹脂的是LSA-33型樹脂，解吸率達到了83.54%，實驗結(jié)果表明LSA-33型大孔樹脂對玉竹總皂苷的吸附率最高，解吸率也相對較高。故選用LSA-33型大孔樹脂作為進一步實驗所用的樹脂型號。

表3 6種孔樹脂對玉竹總皂苷的吸附率與解吸率Table 3 Adsorption and desorption rates of 6 macroporous resins for total saponins in Rhizoma Polygonati Odorati

2.2 單因素試驗

2.2.1 吸附時間對吸附率的影響

圖1 吸附時間對吸附率的影響Fig.1 Effect of adsorption time on adsorption rate

圖1表明，隨著吸附時間的增加，吸附率越大，但到達3h后，增長趨勢趨于平緩，當(dāng)吸附時間為4h時吸附率最大，因此，適宜的吸附時間范圍應(yīng)該為3～5h。為了進一步考察吸附時間對純化效果的影響，選擇吸附時間的因素水平為3.0、3.5、4.0、4.5h進入正交試驗。

2.2.2 解吸液體積分數(shù)對解吸率的影響

圖2 解吸液體積分數(shù)對解吸率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on desorption rate

隨著解吸液體積分數(shù)的增加，LSA-33型大孔樹脂純化玉竹總皂苷的解吸率呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，當(dāng)解吸液體積分數(shù)為90%時，解吸率最高，結(jié)果見圖2。為了進一步考察解吸液解吸液體積分數(shù)對純化效果的影響，所以選擇乙醇體積分數(shù)因素水平為80%、85%、90%、95%進入正交試驗。

2.2.3 解吸液乙醇用量對解吸率的影響

圖3 解吸液乙醇用量對解吸率的影響Fig.3 Effect of solvent consumption on desorption rate

圖3表明，隨著解吸液用量的增大，解吸率呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)解吸液體積與樹脂質(zhì)量比達到35:1時，解吸率最高，之后略有下降。為了進一步考察解吸液用量對純化效果的影響，選擇解吸液用量/樹脂質(zhì)量(mL/g)因素水平為30、32.5、35、37.5進入正交試驗。

2.2.4 解吸時間對解吸率的影響

隨著解吸時間的增加，解吸率越高，當(dāng)?shù)竭_2h時解吸率最大，之后逐步緩慢下降，結(jié)果見圖4。為了進一步考察解吸時間對純化效果的影響，選擇解吸時間的因素水平為1.5、2.0、2.5、3.0h進入正交試驗。

圖4 解吸時間對解吸率的影響Fig.4 Effect of desorption time on desorption rate

2.2.5 樣液pH 值對吸附率的影響

實驗結(jié)果表明，吸附率隨pH值的增大呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，當(dāng)吸附液pH6～7時，吸附率最高，之后吸附率隨pH值的增大明顯下降，所以在實驗中將吸附液的pH值固定在6～7范圍內(nèi)即可，結(jié)果見圖5。

圖5 樣液pH值對吸附率的影響Fig.5 Effect of initial sample pH on adsorption rate

2.3 正交試驗

表4 大孔樹脂純化玉竹總皂苷工藝正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Orthogonal array design protocol and corresponding results

試驗結(jié)果表明，4個因素對解吸率的影響順序為：解吸液用量與樹脂質(zhì)量比＞解吸液體積分數(shù)＞吸附時間＞解吸時間。大孔樹脂靜態(tài)純化玉竹總皂苷的最佳條件為樣品液pH6～7，吸附時間4h，解吸液體積分數(shù)95%，解吸液體積與樹脂質(zhì)量比為37.5:1，解吸時間2h。

2.4 工藝驗證實驗

經(jīng)過上述單因素和正交試驗的考察，得出采用LSA-33型樹脂純化玉竹總皂苷的較佳工藝：樣品液pH值為6～7，吸附時間4h，解吸液體積分數(shù)95%，解吸液用量與樹脂質(zhì)量比為37.5，解吸時間2h。為了考察上述優(yōu)化工藝的穩(wěn)定性，進行了3次驗證實驗，結(jié)果表明3次實驗的吸附率和解吸率分別為50.07%、50.24%、 49.55%和71.38%、71.41%、70.68%，平均吸附率和解吸率分別為49.95%和71.16%，具有較好的重現(xiàn)性。

2.5 浸膏中總皂苷含量的測定

按上述優(yōu)化的工藝進行3次實驗，經(jīng)LSA-33型大孔吸附樹脂處理玉竹總皂苷樣品液后，玉竹總皂苷干膏中總皂苷純度由大約12%提高到42%左右，結(jié)果見表5。

表5 工藝驗證實驗結(jié)果Table 5 Results obtained for experimental validation of optimal purification parameters

3 結(jié) 論

本實驗對6種不同型號的大孔吸附樹脂進行了玉竹總皂苷純化實驗，通過對影響大孔吸附樹脂吸附及解吸各種因素的系統(tǒng)研究，初步確定了LSA-33型大孔吸附樹脂分離純化玉竹總皂苷的效果比較理想，其最佳工藝為：樣品液pH值為6～7、吸附時間為4h、解吸液體積分數(shù)95%、解吸液用量與樹脂質(zhì)量比為37.5:1(mL/g)、解吸時間2h。在該條件下，純化產(chǎn)品中總皂苷的純度由原來的12.28%提高到42%左右，樹脂富集倍數(shù)為3倍以上，表明LSA-33型大孔樹脂對玉竹總皂苷具有良好的純化性能，為玉竹總皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

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Purification of Total Saponins fromRhizoma Polygonati Odoratiby Macroporous Resin Adsorption

WANG Xiao-lin，LI Zhen，ZHONG Fang-li*
(School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering, Jilin Institute of Chemical Technology, Jilin 132022, China)

Objectives: To find out the best type of macroporous resin and determine the optimal process conditions for separation and purification of total saponins fromRhizoma Polygonati Odorati. Methods: The best type of macroporous adsorption resin for total saponins was determined by static adsorption and desorption experiments. Based on one-factor-at-atime experiments, a four-factor, three-level orthogonal array design was employed for the optimization of four process parameters for improved adsorption and desorption rates. Results: LSA-33 macroporous resin was found to be the best resin among 6 types of macroporous resin tested. The best purification conditions for total saponins were determined as follows: crude extract fromRhizoma Polygonati Odorati(pH 6－7) was adsorbed for 4 h and then desorbed with 95% ethanol at a solvent-tosolid ratio of 37.5:1 (mL/g) for 2 h. As a result, the content of total saponins in the crude extract was increased to 41.75% from 12.28%. Conclusion: LSA-33 macroporous resin is effective in purifying total saponins fromRhizoma Polygonati Odoratiwith the advantages of easy operation, high safety and low cost and thus will have high application value.

Rhizoma Polygonati Odorati；total saponins；macroporous resin；purification

R283.2

A

1002-6630(2012)18-0083-05

2011-08-04

王曉林(1969—)，男，副教授，碩士，主要從事天然產(chǎn)物有效成分的提取及純化工藝研究。E-mail：wangxiaolin69@eyou.com

*通信作者：鐘方麗(1970—)，女，教授，博士，主要從事食品及天然藥物研究。E-mail：fanglizhong@sina.com