響應(yīng)面法優(yōu)化臍橙渣中類(lèi)檸檬苦素的提取工藝

吳笑臣，王科軍，鐘金蓮，羅序中*

(贛南師范學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江西 贛州 341000)

響應(yīng)面法優(yōu)化臍橙渣中類(lèi)檸檬苦素的提取工藝

吳笑臣，王科軍，鐘金蓮，羅序中*

(贛南師范學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江西 贛州 341000)

以贛南臍橙渣為原料、乙醇為溶劑，通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法，建立乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、提取溫度與類(lèi)檸檬苦素得率之間的回歸方程，對(duì)臍橙渣中類(lèi)檸檬苦素的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)82%、超聲時(shí)間18min、提取溫度60℃。此條件下類(lèi)檸檬苦素得率為1.632‰，與預(yù)測(cè)值1.651‰較為一致。

臍橙渣；類(lèi)檸檬苦素；提?。豁憫?yīng)面法；優(yōu)化

研究表明，類(lèi)檸檬苦素(limonoids)在抗癌[1]、鎮(zhèn)痛[2]、抑菌[3]、抗氧化[4]和除蟲(chóng)[5]等方面都具有顯著效果，在功能食品、保健品等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，其提取工藝和藥用功能已成為當(dāng)今植物藥物研究的熱點(diǎn)[6-8]。類(lèi)檸檬苦素是主要由蕓香科和楝科植物產(chǎn)生的三萜類(lèi)次生代謝物質(zhì)[9-10]，含量不高，需要大量的植物資源才能滿(mǎn)足其工業(yè)化生產(chǎn)，因此原料供應(yīng)不足是類(lèi)檸檬苦素開(kāi)發(fā)面臨的首要問(wèn)題[11]。臍橙是贛南地方經(jīng)濟(jì)的重要支柱產(chǎn)業(yè)，2010年產(chǎn)量近200萬(wàn)噸。隨著贛南臍橙榨汁加工業(yè)的快速發(fā)展，每年都會(huì)產(chǎn)生大量的臍橙渣，這些殘?jiān)泻性S多重要的生物活性物質(zhì)，如類(lèi)檸檬苦素、黃酮類(lèi)化合物等[12]。目前國(guó)內(nèi)柑橘加工后的皮渣一般作為飼料、肥料或廢棄物處理，經(jīng)濟(jì)效益低，且易污染環(huán)境[13]。因此充分利用臍橙渣資源，提取其中寶貴的生物活性物質(zhì)，對(duì)提高臍橙產(chǎn)品附加值和保護(hù)環(huán)境都具有非常重要的意義。本實(shí)驗(yàn)利用乙醇溶液為提取劑，超聲波輔助提取臍橙渣中類(lèi)檸檬苦素，并結(jié)合Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)、響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，從而提高臍橙類(lèi)檸檬苦素的產(chǎn)率，為贛南臍橙渣資源的研究開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮臍橙榨汁后剩余皮渣 江西省臍橙工程技術(shù)研究中心。檸檬苦素標(biāo)樣 美國(guó)Sigma公司；石油醚、乙醇、二氯甲烷、硫酸、氯化鐵、對(duì)-二甲氨基苯甲醛等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭伙@色試劑A液：量取65mL濃硫酸和35mL無(wú)水乙醇，將其混合，待冷卻后加入125mg對(duì)-二甲氨基苯甲醛；顯色試劑B液：稱(chēng)取9.0g氯化鐵，用蒸餾水溶解并定容至100mL，使用時(shí)向顯色試劑A液中加入0.05mL顯色試劑B液并混勻[14]。

1.2 儀器與設(shè)備

DZF-6090型真空干燥箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；SK7210HP型超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 上海亞榮生化儀器廠；WFJ 7200型分光光度計(jì) 尤尼柯上海儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備[15]

將臍橙渣干燥后過(guò)40目篩，用石油醚回流脫脂24h后備用。準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品5g，加入乙醇溶液冰浴超聲。處理后用保鮮膜密封燒杯，水浴浸提。一定時(shí)間后抽濾，濾液減壓蒸餾得浸膏，用少量二氯甲烷溶解浸膏后抽濾，將濾液旋干，加10mL無(wú)水乙醇溶解，得類(lèi)檸檬苦素提取液。

1.3.2 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和檸檬苦素的定量分析方法

精確稱(chēng)取檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品9.2mg，用無(wú)水乙醇溶解并定容50mL，得質(zhì)量濃度184mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取2mL標(biāo)樣和2mL乙醇溶液于兩只10mL試管中，并在每個(gè)試管中分別加入5mL顯色試劑顯色30min后在分光光度計(jì)400～600nm波長(zhǎng)處進(jìn)行吸收光譜掃描，得到最大吸收峰為550nm。取6支試管，分別加入0、0.4、0.8、1.2、1.6、2mL上述檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)溶液，加無(wú)水乙醇至2mL，按上述方法顯色，以檸檬苦素空白液為參比，在550nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以吸光度對(duì)檸檬苦素的質(zhì)量濃度作圖，得出檸檬苦素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為y＝0.0024x＋0.0007，r＝0.9994。

精確吸取一定量的樣品制備液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定樣品制備液的吸光度，并通過(guò)回歸方程計(jì)算提取液中檸檬苦素質(zhì)量濃度。計(jì)算臍橙渣中類(lèi)檸檬苦素得率。

式中：c為提取液中類(lèi)檸檬苦素的質(zhì)量濃度/(μg/mL)；V為提取液體積/mL；m為臍橙渣的質(zhì)量/g。

1.3.3 類(lèi)檸檬苦素超聲提取條件的優(yōu)化

1.3.3.1 Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)設(shè)計(jì)[16]

根據(jù)前期單因素試驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[17]，通過(guò)PB試驗(yàn)對(duì)影響臍橙類(lèi)檸檬苦素得率的6個(gè)因素即乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲功率、超聲時(shí)間、提取溫度、提取時(shí)間和2個(gè)虛擬變量進(jìn)行篩選，找出主要影響因素。每個(gè)因素設(shè)高(＋)、低(－)兩個(gè)水平共12個(gè)處理，各因素水平設(shè)置見(jiàn)表1。

表1 臍橙渣類(lèi)檸檬苦素提取工藝Plackett-Burman試驗(yàn)優(yōu)化因素水平表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in Plackett-Burman design

1.3.3.2 最陡爬坡試驗(yàn)[18]

根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，以擬合的一階模型回歸系數(shù)的符號(hào)和大小來(lái)設(shè)計(jì)顯著因素的最陡爬坡方向及步長(zhǎng)，使主要因素同時(shí)朝響應(yīng)值增大的方向變化，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，找出峰值，從而逼近最大響應(yīng)區(qū)域。

1.3.3.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)(Box-Behnken Design，BBD)[19]

以臍橙類(lèi)檸檬苦素得率為響應(yīng)值，采用三因素三水平的BBD試驗(yàn)方案對(duì)影響臍橙類(lèi)檸檬苦素的3個(gè)主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化，其中心點(diǎn)取最陡爬坡試驗(yàn)最大響應(yīng)值時(shí)的水平值。然后對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得到二階響應(yīng)面模型，確定最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件，并進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

表2為PB試驗(yàn)各因素的偏回歸系數(shù)及其顯著性分析。結(jié)果顯示，回歸模型的P＝0.0238(P＜0.05)，決定系數(shù)R2＝97.57%，說(shuō)明回歸方程擬合很好。由各因素顯著性效應(yīng)可以看出，對(duì)臍橙類(lèi)檸檬苦素提取得率影響顯著的是乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、提取溫度(P＜0.05)，且三者對(duì)得率均呈正效應(yīng)，與文獻(xiàn)相一致[11,20]。因此，利用響應(yīng)面分析法對(duì)此三因素之間的相互關(guān)系進(jìn)行更深入的研究。其他因素對(duì)類(lèi)檸檬苦素得率影響不顯著，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的用量均維持低水平。

表2 偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析Table 2 Partial regression coefficients and significance analysis of the fitted regression model based on Plackett-Burman design

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、提取溫度三因素效應(yīng)大小的比例和實(shí)際情況，設(shè)計(jì)其變化方向和步長(zhǎng)并進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可以看出，最優(yōu)提取條件可能在處理2和處理4之間，故以處理3為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Steepest ascent design and results

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 數(shù)學(xué)模型的建立與檢驗(yàn)

利用Design-Expert軟件中BBD試驗(yàn)，得到臍橙類(lèi)檸檬苦素提取的三因素三水平試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表4。擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)得到二次回歸模型：Y＝－50.0053＋1.042544X1＋0.332452X2＋0.208066X3－0.0028X1X2－0.00034X1X3＋0.000365X2X3－0.006X12－0.00346X22－0.00163X32。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Box-Behnken design and corresponding experimental results

對(duì)二次回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5?？梢钥闯觯撃Ｐ托?yīng)極顯著(P＝0.0005＜0.05)。各因素中一次項(xiàng)X1、二次項(xiàng)X12、X32及交互項(xiàng)X1X2均表現(xiàn)出了顯著水平，交互項(xiàng)X1X3、X2X3不顯著?；貧w模型的決定系數(shù)為0.9579，修正決定系數(shù)為0.9038，即90.38%的數(shù)據(jù)可用此模型解釋?zhuān)M項(xiàng)差異不顯著，說(shuō)明回歸方程擬合程度高，可以應(yīng)用于從臍橙中提取類(lèi)檸檬苦素的分析預(yù)測(cè)。

表5 二次多項(xiàng)模型方差分析表Table 5 Analysis of variance for the fitted quadratic model based on Box-Behnken design

2.3.2 響應(yīng)面及等高線分析

為了考察交互項(xiàng)對(duì)類(lèi)檸檬苦素得率的影響，在其他因素固定不變的情況下，利用Design-Expert 7.1軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行運(yùn)算，作出交互項(xiàng)的響應(yīng)曲面圖及等高線圖，見(jiàn)圖1。

圖1 各兩因素交互作用對(duì)類(lèi)檸檬苦素得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.1 Response surface plots showing the pairwise interaction effects of extraction parameters on the extraction yield of limonoids

圖1a顯示提取溫度為60℃時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間對(duì)類(lèi)檸檬苦素得率的影響。首先，在不同的超聲時(shí)間條件下隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，類(lèi)檸檬苦素得率均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。這可能是由于乙醇具有一定的極性，若體積分?jǐn)?shù)過(guò)高則不利于非極性、弱極性類(lèi)型的類(lèi)檸檬苦素的溶出從而使提取率下降[21]。其次，類(lèi)檸檬苦素得率的變化幅度不同，超聲時(shí)間短的條件下其變化幅度要大于超聲時(shí)間長(zhǎng)的。這是因?yàn)槟毘仍诔暱栈?、乙醇浸泡等多種因素的作用下，類(lèi)檸檬苦素溶出的速度和總量發(fā)生復(fù)雜的變化。在超聲時(shí)間較短時(shí)，空化作用弱，類(lèi)檸檬苦素的溶出主要依賴(lài)于乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高；隨著超聲時(shí)間增大，空化作用加強(qiáng)，則乙醇體積分?jǐn)?shù)升高產(chǎn)生的效應(yīng)相對(duì)減弱?？梢?jiàn)在不同的超聲時(shí)間條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化對(duì)類(lèi)檸檬苦素得率的影響是不同的，二者交互作用顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖1b表示超聲時(shí)間為20min時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度的交互作用。圖1c表示乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，超聲時(shí)間和提取溫度的交互作用。類(lèi)檸檬苦素得率均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，但交互作用不顯著。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由Design-Expert 7.1.6軟件給出最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)81.59%、超聲時(shí)間18.11min、提取溫度58.78℃，其對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值為1.651‰?？紤]到實(shí)際情況，將最優(yōu)條件定為乙醇體積分?jǐn)?shù)8 2%、超聲時(shí)間18min、提取溫度60℃，其他因素不變的情況下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，類(lèi)檸檬苦素平均得率為1.632‰，與預(yù)測(cè)值接近，表明該模型能較好地預(yù)測(cè)臍橙渣中類(lèi)檸檬苦素的提取情況。

3 結(jié) 論

通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)、Box-Behnken試驗(yàn)建立乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、超聲時(shí)間(X2)、提取溫度(X3)與臍橙渣中類(lèi)檸檬苦素得率之間的回歸方程，各因素中乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、二次項(xiàng)X12、X32及乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間的交互(X1X2)對(duì)類(lèi)檸檬苦素的提取效果影響顯著；得到最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)82%、超聲時(shí)間18min、提取溫度60℃。在此條件下，類(lèi)檸檬苦素的得率為1.632‰，與預(yù)測(cè)值1.651‰基本一致，回歸模型可較好地預(yù)測(cè)臍橙渣中類(lèi)檸檬苦素的提取情況。

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Optimization of Extraction Process for Limonoids from Navel Orange Residues by Response Surface Methodology

WU Xiao-chen，WANG Ke-jun，ZHONG Jin-lian，LUO Xu-zhong*
(College of Life and Environmental Science, Gannan Normal University, Ganzhou 341000, China)

An ultrasonic-assisted method to extract limonoids from navel orange residues left over from juicing using ethanol as the extraction solvent was proposed and optimized. Ethanol concentration, ultrasonic treatment time and extraction temperature were identified as main parameters that influence limonoids yield using Plackett-Burman design combined with the steepest ascent method. A regression equation reflecting the relationship between limonoids yield and these main affecting parameters was established based on Box-Behnken experimental design to optimize the three extraction parameters using response surface methodology.The optimal ethanol concentration, ultrasonic treatment time and extraction temperature were 82%, 18 min and 60 ℃, respectively.Under these conditions, the actual extraction yield of limonoids was 1.632‰, which was close to the predicted value of 1.651‰.

navel orange residue；limonoids；extraction；response surface methodology；optimization

TS201.2

A

1002-6630(2012)16-0035-05

2011-06-09

江西省科技廳科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2010BNB1400)；江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(GJJ10587)；江西省教育廳青年科學(xué)基金項(xiàng)目(GJJ11214)；贛州市果業(yè)基金項(xiàng)目(GZGY2008-1)；贛南師范學(xué)院自然科學(xué)研究課題(09kyz10)

吳笑臣(1975—)，男，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称芳庸ぜ夹g(shù)。E-mail：wuxiaochen1111@126.com

*通信作者：羅序中(1969—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称芳庸ぜ夹g(shù)及有機(jī)小分子凝膠。E-mail：luoxuzhong@yahoo.com.cn