婁倫美，董 志△，傅潔民，曾凡新，姜立花

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 400016；2.重慶復(fù)創(chuàng)醫(yī)藥研究有限公司 400061）

YN33系列化合物抗腫瘤作用的初步研究＊

婁倫美1，董 志1△，傅潔民2，曾凡新2，姜立花2

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 400016；2.重慶復(fù)創(chuàng)醫(yī)藥研究有限公司 400061）

目的從8個YN33系列表皮生長因子受體（EGFR）蛋白酪氨酸酶抑制劑中篩選具有抗腫瘤活性的化合物，并進一步評價其在體外的抗腫瘤效果。方法首先采用體外激酶實驗對YN33系列化合物進行初步篩選，觀察它們對EGFR蛋白酪氨酸酶的抑制作用；采用MTS法觀察篩選出的活性化合物在體外對人表皮癌A431細(xì)胞株、人胃癌N87細(xì)胞株和人乳腺癌BT474細(xì)胞株的增殖抑制作用，以及體外篩選出的YN33－5化合物對人正常胚肺成纖維MRC－5細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)果激酶實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)4個具有抑制EGFR活性的化合物：YN33－3，YN33－5，YN33－6，YN33－8。YN33－5對 A431、BT474、N87細(xì)胞株的半數(shù)抑瘤濃度（IC50）分別為：（9.743 3±2.795 9）μmol/L，（4.611 7±2.222 5）nmol/L和（44.048 3±21.793 1）nmol/L，抑制效應(yīng)呈劑量依賴性。結(jié)論YN33－5具有較好抗腫瘤活性，可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖。

受體，表皮生長因子；抗腫瘤活性；MTS法

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）屬于erbB家族成員之一，是由胞外配體結(jié)合區(qū)，跨膜區(qū)具有酪氨酸激酶活性的胞內(nèi)區(qū)3個部分組成的跨膜糖蛋白。EGFR在多種惡性腫瘤存在表達(dá)，如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、乳腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞中都有過度表達(dá)，激活EGFR會促進腫瘤細(xì)胞增殖，腫瘤血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移，阻礙腫瘤凋亡［1］。國外已開發(fā)了多種臨床療效較好的酪氨酸激酶靶向藥物，但目前這些藥物有諸多缺點，如抗瘤譜窄、僅對部分腫瘤有效、遠(yuǎn)期療效和安全性尚不明確，而且價格昂貴導(dǎo)致這些藥物的臨床應(yīng)用受到很大限制。為研發(fā)更有效的EGFR酪氨酸激酶抑制劑，以Lapatinib為母核進行結(jié)構(gòu)改造，合成了YN33系列化合物。本研究通過對該系列化合物進行體外篩選，期望發(fā)現(xiàn)具有較強抗腫瘤活性的化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細(xì)胞株 人表皮癌A431細(xì)胞株、人乳腺導(dǎo)管癌BT474及人胃癌N87細(xì)胞株和人正常胚肺成纖維MRC－5細(xì)胞株，均購自上海中科院細(xì)胞庫。A431、BT474和 MRC－5細(xì)胞株用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，在BT474和MRC－5細(xì)胞株的培養(yǎng)液需加入1.0mmol/L的丙酮酸鈉；N87細(xì)胞株用RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，需加入110mg/L的丙酮酸鈉及10 mmol/L的羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）。均置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3～4d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗研究。

1.1.2 試藥與試劑 YN33系列化合物共8個樣品和陽性對照藥Lapatinib，均由重慶復(fù)創(chuàng)醫(yī)藥有限公司提供，純度為95%，呈黃色粉末狀，用二甲基亞砜（DMSO）溶解，配制成20 mmol/L溶液，－80℃保存?zhèn)溆檬褂们坝贸兯蚺囵B(yǎng)液配制成所需濃度。ADP－GloTM激酶檢測試劑盒及MTS為Promega公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清（FBS）為Gibco公司產(chǎn)品；胰蛋白酶和臺盼藍(lán)為Sigma公司產(chǎn)品；DMSO為國藥公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 ADP－GloTM激酶檢測YN33系列化合物對EGFR激酶活性的影響 運用ADP－GloTM激酶檢測試劑盒檢測YN33系列化合物對EGFR激酶的抑制活性測定，以Lapatinib作為陽性對照藥物驗證篩選模型的靈敏度和穩(wěn)定性。所有反應(yīng)均在96孔酶標(biāo)板中完成，經(jīng)過酶濃度篩選每孔分別加入0.5U/mL的酶液10μL。為減少加樣時的誤差，將酶以外的其余試劑混合，分別加入超純水2.5μL、反應(yīng)緩沖液（5倍）5μL、ATP（1 μmol/L）2.5μL及底物（500μmol/L）2.5μL，混勻后，取12μL混合物后，加入待測化合物（100nmol/L）2.5μL，最后加入酶液，反應(yīng)總體積為25μL。實驗分組為：實驗組、化合物組、無酶對照組及陰性對照組。將化合物組，無酶對照組及陰性對照組在30℃保溫反應(yīng)60min后，避光加入熒光素酶/熒光素反應(yīng)檢測試劑25μL。在450nm吸光處測定吸光值（OD值），計算抑制率（CI），公式如下：CI（%）＝（化合物OD值－陰性對照孔OD值）/（無酶對照孔OD值－陰性對照孔OD值）×100%。

表1 培養(yǎng)時間和給藥濃度對照表

1.2.2 YN33系列化合物對腫瘤細(xì)胞及 MRC－5細(xì)胞的增殖抑制實驗 將A431，BT474和N87腫瘤細(xì)胞株及 MRC－5正常細(xì)胞株按照常規(guī)方法傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）消化后配成單細(xì)胞懸液（細(xì)胞懸液濃度表1），接種于96孔板，每孔100μL，置37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)各自對應(yīng)的時間（培養(yǎng)時間表1）后，A431和N87細(xì)胞株需要將培養(yǎng)液吸出，再加入100μL含不同濃度待測化合物和對照藥的培養(yǎng)液（給藥濃度見表1），BT474和MRC－5細(xì)胞株是直接加入，3種細(xì)胞均為9個濃度梯度。實驗設(shè)藥物處理組、實驗對照組和空白對照組，每組均設(shè)3個復(fù)孔。置37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)各自對應(yīng)的時間后（表1），吸出培養(yǎng)液，用PBS輕輕沖洗幾次后，加入100μL的無血清培養(yǎng)基，再加入10μL的MTS，繼續(xù)培養(yǎng)2h，于多功能酶標(biāo)儀490nm波長處測吸收度值（A490nm），按下式計算CI，并采用GraphPad Prism5軟件計算半數(shù)抑瘤濃度（IC50）值。腫瘤細(xì)胞生長CI（%）＝［1－（藥物處理組OD值－空白對照組OD值）/（實驗對照組OD值－空白對照組OD值）］×100。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)±s表示，多樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 YN33系列化合物對EGFR激酶活性的影響 在篩選中發(fā)現(xiàn)，YN33系列化合物對EGFR激酶均表現(xiàn)出不同的抑制作用，以Lapatinib為對照，從實驗結(jié)果顯示，YN33－5化合物能明顯抑制EGFR激酶的活性，而YN33－4抑制EGFR激酶活性很弱，與Lapatinib比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.2 對腫瘤細(xì)胞生長的影響 經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，選定YN33－3，YN33－5，YN33－6，YN33－8化合物進行腫瘤細(xì)胞增殖抑制實驗。從篩選中發(fā)現(xiàn)，YN33系列化合物對A431、BT474及N87細(xì)胞株均表現(xiàn)出了不同程度的抑制作用，表現(xiàn)為濃度依賴性（表3）。以Lapatinib為對照，其中YN33－5化合物對3種細(xì)胞具有較強的增殖抑制作用，同時表現(xiàn)了良好的量效關(guān)系。

2.3 對正常細(xì)胞生長的影響 通過腫瘤細(xì)胞增殖抑制實驗，發(fā)現(xiàn)YN33－5化合物具有較強的抗腫瘤活性，故選定YN33－5化合物檢測其對人正常胚肺成纖維 MRC－5細(xì)胞的影響，以Lapatinib為對照，實驗結(jié)果顯示，Lapatinib和 YN33－5對MRC－5 細(xì) 胞 IC50為 （40.541 7±8.061 6）μmol/L 和（28.345 0±3.651 4）μmol/L。YN33－5化合物對 MRC－5細(xì)胞的殺傷作用相對Lapatinib較強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 對EGFR激酶活性的影響（±s，n＝6）

表2 對EGFR激酶活性的影響（±s，n＝6）

－：表示無數(shù)據(jù)。

待測物 CI（%）PLapatinib 38.738 9±3.368 3 －YN33－2 30.500 0±9.502 6 ＜0.05 YN33－3 32.166 7±8.727 4 －YN33－4 0.233 3±0.135 5 ＜0.05 YN33－5 42.000 0±11.781 3 ＜0.01 YN33－6 19.729 7±3.668 4 －YN33－7 18.833 3±7.884 6 ＜0.05 YN33－8 31.212 0±3.593 4 －YN33－9 0.351 0±0.234 8 ＜0.05

表3 對腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用（±s，n＝6）

表3 對腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用（±s，n＝6）

a：P＜0.05；b：P＜0.01，與Lapatinib比較。

待a

3 討 論

抗腫瘤藥物抑制作用的體外實驗是整個抗腫瘤藥物藥理研究過程中的重要環(huán)節(jié)，在篩選有效的抗癌藥物，輔助判斷抗癌藥物的抗癌譜等方面均有重要價值。乳腺癌細(xì)胞中存在EGFR的高表達(dá)可用于預(yù)測其病情的發(fā)展與療效及預(yù)后的判定［1］。EGFR胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的酪氨酸激酶活性是EGFR發(fā)揮生物學(xué)作用的主要途徑，抑制該酶活性可獲得相似的抗腫瘤作用。Lapatinib（GW572016）為6－噻唑基喹唑啉，是一個可逆性的酪氨酸激酶抑制劑，生化試驗中表現(xiàn)出選擇性抑制EGFR家族激酶EGFR和 HER－2，是由Glaxo Wellcome公司研發(fā)針對EGFR/HER－2的雙重抑制劑［2］。

Lapatinib可抑制EGFR和HER－2磷酸化激活及細(xì)胞增殖。有文獻(xiàn)報道，Lapatinib的抗增殖作用在高表達(dá)HER－2的細(xì)胞中較強，而在低表達(dá) HER－2或表達(dá)EGFR的細(xì)胞中較弱［3］。Lapatinib對乳腺癌細(xì)胞增生的抑制呈濃度依賴性，不同細(xì)胞株的IC50不同，在某些乳腺癌細(xì)胞株中，IC50＜0.2μmol/L時，Lapatinib即可發(fā)揮作用，顯示出強大的抗增殖作用［4］。有研究顯示，Lapatinib可明顯抑制BT474（HER2過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞株［5］）細(xì)胞中p95的磷酸化及移植瘤的生長［6］，A431細(xì)胞為 EGFR過表達(dá)細(xì)胞株［7］。

在抗腫瘤增殖抑制實驗中，設(shè)定了相應(yīng)DMSO濃度的陰性對照，以消除DMSO對細(xì)胞活性的影響，同時將各實驗組的DMSO濃度控制在0.1%以內(nèi)，以盡量減少對實驗的影響。從實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，雖然A431細(xì)胞株的EGFR水平都比較高，但Lapatinib對 A431細(xì)胞的IC50在（22.540 0±7.436 8）μmol/L。在文獻(xiàn)中報道，Lapatinib對EGFR/HER－2的IC50分別為10.2nmol/L和9.8nmol/L［8］，對 A431、BT474、N87細(xì)胞株的IC50小于1.6×102nmol/L［2］。Lapatinib在BT474、N87細(xì)胞株中的IC50分別為 （5.713 3±4.027 8）nmol/L 和（45.750 0±8.539 8）nmol/L，均小于1.6×102nmol/L。提示腫瘤細(xì)胞對活性化合物的敏感性可能與EGFR表達(dá)水平無明顯相關(guān)性，或者并不僅僅與之相關(guān)。經(jīng)過對YN33系列化合物的體外篩選，本研究發(fā)現(xiàn)YN33系列化合物對A431、BT474、N87 3個腫瘤細(xì)胞株均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，而且呈明顯的量效關(guān)系，在所設(shè)濃度范圍內(nèi)，其抑制作用隨濃度的增加而增強，并從中發(fā)現(xiàn)YN33－5化合物具有顯著的抗腫瘤活性，與初步篩選實驗結(jié)果相符。

在實驗篩選中，發(fā)現(xiàn)YN33－5化合物的作用與Lapatinib相當(dāng)，但在正常細(xì)胞生長抑制實驗中發(fā)現(xiàn)，YN33－5化合物對MRC－5細(xì)胞株的殺傷作用略高于Lapatinib，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。由于只選用了一種正常細(xì)胞株來檢測YN33－5化合物對正常細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，還不足以說明YN33－5化合物的毒副作用。

綜上所述，在本研究中，進行體外初步篩選，發(fā)現(xiàn)了YN33－5化合物是具有顯著抗腫瘤活性的化合物。但對于化合物對腫瘤的治療效果不能僅僅依靠對腫瘤細(xì)胞的抑制作用，還必須確認(rèn)其能夠在復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境中抑制腫瘤的生長。本研究只表明了YN33－5化合物在體外有顯著的抗腫瘤活性，其通過抑制EGFR激酶而抑制腫瘤細(xì)胞生長的確切機制，需要對其在體內(nèi)的抗腫瘤活性作進一步的研究。

［1］謝富華，王潤秀，梁念慈.表皮生長因子受體家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與乳腺癌關(guān)系的研究進展［J］.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2006，27（11）：1004－1005.

［2］陶黎陽，符立梧.EGFR/HER－2雙受體酪氨酸激酶抑制劑拉帕替尼的研究進展［J］.中國藥理學(xué)通報，2008，24（12）：1541－1544.

［3］Konecny GE，Pegram MD，Venkatesan N，et al.Activity of the dual kinase inhibitor lapatinib（GW572016）against HER－2－overexpressing and trastuzumab－treated breast cancer cells［J］.Cancer Res，2006，66（3）：1630－1639.

［4］Xia W，Mullin RJ，Keith BR，et al.Anti－tumor activity of GW572016：a dual tyrosine kinase inhibitor blocks EGF activation of E8GFR/erbB2and downstream Erk1/2and AKT pathways［J］.Oncogene，2002，21（41）：6225－6263.

［5］Evans AH，Pancholi S，F(xiàn)armer I，et al.EGFR/HER2inhibitor AEE788increases ER－mediated transcription in HER2/ER－positive breast cancer cells but functions synergistically with endocrine therapy［J］.Br J Cancer，2010，102（8）：1235－1243.

［6］Xia W，Liu LH，Ho P，et al.Truncated ErbB2receptor（p95ErbB2）is regulated by heregulin through heterodimer formation with ErbB3yet remains sensitive to the dual EGFR/ErbB2kinase inhibitor GW572016［J］.Oncogene，2004，23（3）：646－653.

［7］Ciardiello F，Caputo R，Bianco R，et al.Antitumor effect and potentiation of cytotoxic drugs activity in human cancer cells by ZD1839（Iressa），an epidermal growth factor receptor－selective tyrosine kinase inhibitor［J］.Clin Cancer Res，2000，6：2053－2063.

［8］Rusnak DW，Lackey K，Affleck K，et al.The effects of the novel，reversible epidermal growth factor receptor/ErbB－2 tyrosine kinase inhibitor，GW572016，on the growth of human normal and tumor－derived cell lines in vitro and in vivo［J］.Mol Cancer Ther，2001，1（2）：85－94.

Preliminary study on the anti－tumor role of YN33 series compounds＊

LouLunmei1，DongZhi1△，F(xiàn)uJiemin2，ZengFanxin2，JiangLihua2
（1.SchoolofPharmacy，ChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China；2.ChongqingFuchuang PharmaceuticalResearchInstitute，Chongqing400061，China）

ObjectiveTo screen 8series of YN33compounds，which are EGFR tyrosine kinase inhibitors，and evaluate their anti－tumor effectinvitro.MethodsPreliminary screening was carried out by detecting the EGFR kinase phosphorylation inhibition activity of the compounds.MTS assay was adopted for secondary anti－tumor screen of the selected compounds using A431，N87and BT474cell linesinvitro.And we investigated the influence caused by the screened compound YN33－5in normal cells，MTS assay was carried out in MRC－5cell line as well.ResultsAccording to the kinase assay，4compounds were selected，which were YN33－3，YN33－5，YN33－6，and YN33－8.The IC50of YN33－5in inhibition of A431，BT474and N87cell lines proliferationinvitrowas（9.743 3±2.795 9）μmol/L，（4.6117±2.222 5）nmol/L and（44.048 3±21.793 1）nmol/L，and the inhibition effect were dose－dependent.ConclusionYN33－5is probably an effective EGFR tyrosine kinase inhibitor with significant anti－tumor activity.

recetptor，epidermal growth factor；anti－tumor activity；MTS assay

10.3969/j.issn.1671－8348.2012.33.015

A

1671－8348（2012）33－3498－03

國家科技部重大專項（010ZX09401－306－1－1）。△ 通訊作者，Tel：13508393231；E－mail：zhidong073＠hotmail.com。

2012－04－04

2012－06－18）