HPLC法同時測定不同產(chǎn)地五味子中8種木脂素類成分

胡俊揚， 陸兔林， 毛春芹， 蘇 桃， 蔡寶昌

（南京中醫(yī)藥大學藥學院，南京中醫(yī)藥大學江蘇省針灸學結合重點實驗室，江蘇 南京 210046）

五味子是木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實，是我國長期使用的補益類藥物。其味酸、甘，性溫。有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效。用于久嗽虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗、盜汗、津傷口渴、短氣脈虛、內(nèi)熱消渴、心悸失眠等癥［1］。五味子中含有多糖、揮發(fā)油和木脂素類成分［2-4］，其中木脂素類成分與其具有抗肝臟損傷、抗氧化的作用明顯相關［5-7］。故木脂素的量直接影響五味子的質(zhì)量及臨床應用，由于基因遺傳、生態(tài)環(huán)境、人工栽培、干燥程序、儲存條件等因素的影響，不同產(chǎn)地五味子中木脂素的含有量有所不同。東北三省地區(qū)一直被視為五味子的道地產(chǎn)地，有無科學道理，迄今未見系統(tǒng)報道。2010年版《中國藥典》以其中的五味子醇甲作為定量測定的指標，文獻報道測定多集中在五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素中的3種或5種［8-11］。本實驗建立了五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素8種木脂素的高效液相測定方法，并比較了不同產(chǎn)地五味子飲片中8種木脂素的含有量，為更好地控制五味子飲片及其制劑的內(nèi)在質(zhì)量提供了科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，配四元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、UV檢測器、ChemStation工作站控制系統(tǒng)，KQ-500E型醫(yī)用超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司)，電子天平(Mettler Toledo AG285)。

1.2 試藥 五味子醇甲(批號:110857-200709)、五味子醇乙(批號:110543-200708)、五味子酯甲(批號:111529-200503)、五味子甲素(批號:110764-200609)、五味子乙素(批號:110765-200710)，以上對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，供定量測定用；五味子丙素(批號:DR20101018)，購自上海鼎瑞化工有限公司，純度98%以上。戈米辛J(批號:10120821)和戈米辛G(批號:10120822)，購自上海同田生物科技有限公司，純度98%以上。五味子飲片購自安徽銅陵飲片廠，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學藥學院陳建偉教授鑒定均為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實。甲醇、乙腈為色譜純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為依利特ODS-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃。流動相為乙腈(A)-水(B)梯度洗脫，0～17 min，A 為50%；17～25 min，A為50% ～55%；25～30 min，A為55% ～75%；30～35 min，A 為75%；35～40 min，A 為75% ～65%；40～45 min，A為65% ～50%。體積流量1.0 mL/min。檢測波長217 nm，進樣量為10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 對照品(A)與五味子飲片(B)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC Chromatograms of reference substances(A)and Schisandra chinensis(B)

2.2 對照品溶液的配制 分別精密稱取五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、五味子酯甲、戈米辛G、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素對照品適量，用甲醇溶解，配制成單一對照品貯備液。另精密吸取各單一對照品貯備液適量，配制成含五味子醇甲0.2502 mg/mL、戈米辛 J 0.0520 mg/mL、五味子醇乙0.1099 mg/mL、戈米辛 G 0.0255 mg/mL、五味子酯甲0.0379 mg/mL、五味子甲素0.0516 mg/mL、五味子乙素 0.2070 mg/mL、五味子丙素0.0456 mg/mL的混合對照品貯備液，備用。

2.3 供試品溶液的制備 取不同五味子飲片，粉碎，過三號篩，精密稱取約0.3 g，置25 mL量瓶中，加甲醇約20 mL，超聲處理(功率250W，頻率20 kHz)20 min，取出，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關系考察 分別精密吸取混合對照品貯備液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于 1 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度。精密吸取各質(zhì)量濃度混合對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，測定。以峰面積對質(zhì)量濃度進行線性回歸?；貧w方程、線性范圍及相關系數(shù)見表1。

表1 8種木脂素成分的線性關系、回歸方程及相關系數(shù)Tab.1 Linear ranges and correlation of studied lignans

2.5 精密度試驗 將五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素質(zhì)量濃度分別為125.10、26.00、54.95、12.75、18.95、25.70、103.50 和 22.80μg/mL的混合對照品溶液，按2.1項連續(xù)進樣5次，記錄各自峰面積，并計算其RSD值。結果顯示:五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的RSD值分別為:0.14%、0.39%、0.34%、0.38%、0.43%、0.16%、0.11%和0.30%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 精密稱取2.3項下的五味子(遼寧)粉末約0.3 g，共5份，按2.3項下方法制備成供試品溶液，按上述色譜條件進行HPLC分析。根據(jù)所得8種木脂素的峰面積計算其在樣品中的含有量。結果顯示:五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的平均質(zhì)量分數(shù)分別為8.0368、0.4607、1.5276、0.3412、0.4710、3.4370、3.7535和 0.4169 mg/g，RSD分別為 0.12%、0.76%、0.23%、0、92%、0.30%、0.10%、0.13% 和 0.73%，說明此方法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一五味子樣品供試品溶液，室溫放置 0、4、8、12、24 h 后，按上述色譜條件進行HPLC分析，測定8種木脂素的峰面積。結果顯示:五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素在不同時間峰面積的 RSD分別為0.28%、1.22%、0.90%、1.89%、1.17%、0.45%、0.38%和 1.22%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗 分別精密稱取8種對照品適量，置量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素質(zhì)量濃度分別為 1.208、0.07、0.230、0.052 、0.07、0.52、0.56 和0.062 mg/mL的混合對照品溶液，備用。精密稱取已知8種木脂素含有量的五味子樣品約0.15 g，共9份。根據(jù)樣品中五味子醇甲含有量的80%、100%與120%，分別加入混合對照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，各3份，按2.3項下方法制備成供試品溶液，按2.1項進行HPLC分析，根據(jù)測得量和加入量計算回收率。五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的加樣回收率(RSD)分別為99.75%(0.38%)、100.69%(2.31%)、100.46%(1.39%)、99.87%(1.15%)、100.22%(1.45%)、100.15%(0.99%)、100.61% (0.25%) 和 101.31%(1.03%)。符合定量測定要求，表明本法準確可靠。

2.9 樣品測定 取不同產(chǎn)地五味子飲片，粉碎，過三號篩，精密稱取約0.3 g，各3份。按照2.3項下制備成供試品溶液，按2.1項進行HPLC分析，分別進樣10 μL，記錄峰面積，根據(jù)兩點外標法計算樣品中五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、戈米辛G、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的量，結果見表2。

3 討論

3.1 提取方法考察 根據(jù)文獻［12-13］，本實驗比較了甲醇、三氯甲烷和乙醇3種溶劑對五味子木脂素提取率的影響，結果顯示其提取效果甲醇＞乙醇＞三氯甲烷，故以甲醇作為提取溶劑；同時考察了超聲提取法和加熱回流提取法，結果顯示超聲提取效率高于加熱回流提取效率；并對提取時間進行了優(yōu)選，以提取20 min最佳。所以本實驗選擇以甲醇為提取溶劑，以超聲提取法提取20 min為提取方法對五味子木脂素類成分進行提取，且該方法為2010年版《中國藥典》一部五味子項下的定量測定提取方法。

表2 不同樣品中木脂素成分的測定(n=3)Tab.2 Contents of eight studied lignans in Schisandra chinensis(n=3)

3.2 色譜條件的選擇 在實驗中對多個色譜條件進行考察，包括色譜柱的選擇、甲醇-水的不同配比與梯度洗脫和乙腈-水的不同配比與梯度洗脫、檢測波長、柱溫等條件，最終確定了本實驗的色譜條件。

3.3 飲片的選擇 在研究過程中，我們收集了東北三省、湖北、內(nèi)蒙古、山西等產(chǎn)地，但是在該色譜條件下只有東北三省的五味子飲片能夠全部測定其中7種，說明五味子具有道地性。2010年版《中國藥典》只以五味子醇甲不得少于0.4%為測定標準，從表2中可以看出所測樣品中五味子醇甲的質(zhì)量分數(shù)均符合藥典規(guī)定，并且黑龍江產(chǎn)地的8種木脂素成分總量最高，我們又收集了黑龍江不同產(chǎn)地的五味子飲片，發(fā)現(xiàn)并不是黑龍江所有產(chǎn)地的都高，其中以中和鎮(zhèn)地區(qū)的五味子中8種木脂素成分的總量最高。但是所測樣本中8種木脂素成分在總量上沒有顯著性的差異，只是在各成分含有量構成上有所不同。

4 小結

五味子為常用補益藥，但是臨床上用的飲片質(zhì)量參差不齊，木脂素含有量高低不等，療效很難保證。本實驗建立的HPLC方法，樣品中各被測組分的色譜峰基本達到基線分離，并且通過對方法學的考察，顯示該分析方法具有準確、穩(wěn)定、重復性好、靈敏度高等特點。并且從測定結果可以看出，五味子中雖然主要含有五味子醇甲，但是其他成分也并不低，比如在所測樣品中五味子乙素的最低達到了0.37%，所以該研究結果表明單純以五味子醇甲的含有量來評價五味子的質(zhì)量是不夠的，建議進行多指標的定量測定來控制五味子及其制劑的內(nèi)在質(zhì)量。本研究為中國藥典進行多指標成分控制五味子飲片質(zhì)量提供科學依據(jù)，同時為進一步研究五味子及其制劑的質(zhì)量控制、藥理活性以及臨床使用提供了化學成分數(shù)據(jù)支持。

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