劉紅梅，李 丹，郭冠亞，李可意

（北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023）

灰樹花Grifola frondosa為擔(dān)子菌亞門、多孔菌科，又名栗子蘑、蓮花菌、千佛菌等，其主要活性成分是灰樹花多糖，因其有β-(1→6)分支，具有顯著的生理活性，具有抑制腫瘤生長、防止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、防止正常細(xì)胞癌變等作用［1-7］。灰樹花多糖多采用子實(shí)體的水提醇沉或菌絲體發(fā)酵工藝獲得的，多糖純度低，含色素量高，產(chǎn)品呈深褐色，這不僅影響灰樹花多糖的純度和品質(zhì)，也影響其生物活性，同時(shí)也影響對(duì)多糖的進(jìn)一步純化和構(gòu)效關(guān)系的研究。因此，非常有必要對(duì)多糖進(jìn)行脫色處理。

目前常用的脫色方法包括活性炭吸附脫色和雙氧水氧化脫色［8-10］，但采用活性炭吸附脫色，脫色時(shí)間較長，多糖損失較多，多糖中存在活性炭殘留；采用雙氧水氧化脫色，易導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)因氧化而破壞，從而影響其生物活性。大孔樹脂主要利用范德華力對(duì)分子進(jìn)行吸附，具有物理化學(xué)穩(wěn)定性高，吸附選擇性強(qiáng)，富集效果好，解吸條件溫和，再生簡便，使用周期長等諸多優(yōu)點(diǎn)［11-18］。

本實(shí)驗(yàn)選擇6種樹脂，比較其對(duì)灰樹花子實(shí)體酶解液中色素的吸附性能，篩選出較優(yōu)的3種樹脂，通過研究其靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特性以及樹脂用量對(duì)色素脫除率和多糖保留率的影響，篩選出脫除灰樹花子實(shí)體酶解液色素的理想樹脂，并考察料液pH值、料液初始濃度、吸附溫度及洗脫劑體積分?jǐn)?shù)等因素對(duì)色素吸附和解吸效果的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 灰樹花子實(shí)體干品 (20090718)，浙江慶元食用菌研究所。纖維素酶和木瓜蛋白酶，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；果膠酶，杰輝生物技術(shù)有限公司；其他均為國產(chǎn)分析純。HPD 400，AB-8，S-8，D3520，D201，DA201-C吸附樹脂，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備 UV757CRT型紫外分光光度儀，上海精密儀器有限公司；低溫低速離心機(jī)，美國Beckman公司；RE-52A/52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；FA2004精密電子天平，上海恒平科學(xué)儀器有限公司；真空干燥箱，上海精密儀器儀表有限公司；恒溫水浴振蕩器LTA2-SHA-2，上海浦東物理化學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分析方法 多糖含有量的測定:苯酚-硫酸法［19］測多糖含有量，以葡萄糖為對(duì)照品，線性回歸方程為:A=0.5582C+0.1895，R2=0.9997，式中A為吸光度；C為以葡萄糖計(jì)的多糖質(zhì)量濃度 (mg/mL)，多糖質(zhì)量濃度在0.0～1.2 mg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

多糖保留率按式 (1)計(jì)算。

式中:M前、M后分別是樹脂脫色前后料液中多糖的總量(mg)。

脫色率的測定:調(diào)節(jié)待測溶液至中性，420 nm處測吸光度，按式 (2)計(jì)算脫色率。

式中:A脫色前、A脫色后分別為脫色前后溶液的吸光度。

1.2.2 復(fù)合酶-微波輔助萃取提取灰樹花多糖 灰樹花子實(shí)體清水洗凈，真空干燥箱60℃干燥6 h，粉碎機(jī)粉碎，分別過5目和20目篩，取顆粒度在5～20目之間的灰樹花顆粒，裝入清潔干燥的容器中，置于真空干燥箱中備用。

按質(zhì)量比為2∶2∶1的比例稱取木瓜蛋白酶、纖維素酶和果膠酶，混合均勻，超純水溶解，得復(fù)合酶溶液，備用。

稱5～20目灰樹花粉200 g，加10倍超純水，室溫浸泡100 min，按復(fù)合酶與灰樹花粉質(zhì)量比0.4%的比例加入復(fù)合酶溶液，調(diào)pH為6.0，50℃酶解90 min。酶提取液100℃條件下滅酶10 min，冷卻至室溫，過濾，取濾液，得酶提多糖溶液，備用。苯酚-硫酸法測多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞30%。

1.2.3 大孔樹脂的預(yù)處理 大孔樹脂用約2倍樹脂體積的5%鹽酸溶液浸泡6 h，使樹脂充分溶脹，蒸餾水洗至中性，然后用約2倍樹脂體積的5%氫氧化鈉溶液浸泡6 h，蒸餾水洗至中性，再用95%乙醇浸泡6 h，蒸餾水洗至無醇味，備用。

1.2.4 樹脂的初選 精確稱取4.0 g經(jīng)預(yù)處理的樹脂于具塞磨口三角瓶中，加入100 mL初始多糖質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL的灰樹花子實(shí)體酶解液，鹽酸調(diào)pH值為5.0，于恒溫水浴振蕩器中，180 r/min振蕩120 min，4000 r/min離心，過濾，收集濾液，按1.2.2項(xiàng)測多糖濃度和吸光度，計(jì)算多糖保留率和脫色率。

1.2.5 吸附動(dòng)力學(xué)特性測定 精確稱取初步篩選出的經(jīng)預(yù)處理的濕樹脂各4.0 g于具塞磨口三角瓶中，加入一定質(zhì)量濃度的灰樹花子實(shí)體酶解液，于25℃恒溫水浴振蕩器中，180 r/min振蕩，每隔一定時(shí)間取樣，測溶液吸光度和多糖含有量，繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

1.2.6 樹脂的靜態(tài)吸附 精確稱取篩選出的經(jīng)預(yù)處理的濕樹脂4.0 g于具塞磨口三角瓶中，加入一定體積的灰樹花子實(shí)體酶解液，鹽酸調(diào)pH值為5.0，于恒溫水浴振蕩器中，180 r/min振蕩，分別考察樹脂濃度、溶液初始濃度、溶液pH值等條件對(duì)脫色率和多糖保留率的影響。

1.2.7 樹脂的靜態(tài)解吸 精確稱取4.0 g篩選出的經(jīng)預(yù)處理的樹脂6份，分別置于具塞磨口三角瓶中，加入一定體積的灰樹花子實(shí)體酶解液，鹽酸調(diào)pH值為5.0，于恒溫水浴振蕩器中，180 r/min振蕩8 h至吸附平衡 (預(yù)實(shí)驗(yàn)表明已達(dá)到吸附平衡)；過濾，蒸餾水洗滌樹脂，除去樹脂表面吸附的酶解液，濾紙吸干樹脂表面的水分；加入一定體積分?jǐn)?shù)分別為0、20%、40%、60%、80%和95%的乙醇溶液，25℃條件下180 r/min振蕩解吸8 h，測多糖和色素含量，按式 (3)計(jì)算樹脂對(duì)多糖吸附量，按式 (4)和(5)計(jì)算解吸量和解吸率。

式中:Q為多糖吸附量，mg/g；C0為料液的初始多糖質(zhì)量濃度 (mg/mL)；Ce為多糖的平衡吸附濃度 (mg/mL)；m為樹脂質(zhì)量 (g)；V為被吸附溶液的體積 (mL)；QD為多糖解吸量 (mg/g)；Cd解吸液濃度 (mg/mL)；Vd解吸液體積 (mL)；η為樹脂對(duì)多糖的解吸率。

樹脂對(duì)色素的解吸率按式 (6)計(jì)算:

式中:A前、A后分別為吸附前、后料液的吸光度；A解為解析后料液的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔吸附樹脂的篩選 影響大孔樹脂吸附性能的因素很多，包括樹脂的結(jié)構(gòu)、極性、比表面積、粒徑、孔徑及被吸附分子的極性、分子大小等。一般來說，樹脂的極性與被吸附分子的極性相同或相近時(shí)吸附效果更好；樹脂有較大比表面積時(shí)吸附量更大；樹脂孔徑是被吸附分子大小的5～6倍時(shí)吸附性能最好［16］?；覙浠ǘ嗵菍儆谥行缘娜鯓O性分子，酶解液中的色素具有較強(qiáng)的極性。我們選擇了6種樹脂，對(duì)灰樹花子實(shí)體酶解液中的色素和多糖進(jìn)行吸附，結(jié)果見表1。

表1 6種樹脂對(duì)灰樹花子實(shí)體酶解液的脫色效果

從樹脂的極性來看，AB-8、S-8、DA201-C 3種樹脂是極性大孔吸附樹脂，具有一定的親水結(jié)構(gòu)，一般用于從非極性溶劑中吸附極性溶質(zhì)?；覙浠ǘ嗵翘崛∫褐械纳貥O性較強(qiáng)，因此S-8、AB-8、DA201-C型樹脂脫色率比較高，這3種樹脂對(duì)色素的脫出率分別為77.80%、68.01%和64.99%，多糖保留率分別為89.39%、78.49%和86.09%，而HPD400屬于弱極性樹脂，對(duì)色素的吸附率較低，但對(duì)多糖的吸附較強(qiáng)，因此多糖保留率較低，只有48.28%；D3520屬于非極性樹脂，對(duì)色素和多糖的吸附能力均較差。另外，從比表面積來看，DA201-C、HPD400、AB-8、D3520這4種樹脂比表面積都比較大，但HPD400和D3520的孔徑較小，只能吸附分子較小的色素分子，而對(duì)分子較大的色素分子的吸附能力卻較弱，S-8雖然比表面積較小，但卻因具有較大的孔徑，因而對(duì)色素分子的吸附能力較強(qiáng)。

根據(jù)以上結(jié)果進(jìn)行綜合考慮，初步選用AB-8、S-8、DA201-C這3種樹脂進(jìn)行吸附試驗(yàn)，對(duì)樹脂進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

2.2 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線 僅用吸附量來評(píng)價(jià)一種樹脂的分離特性并不客觀，因?yàn)樵谖綍r(shí)間充裕的情況下，一些樹脂可能具有較大的吸附量，但達(dá)到吸附平衡的時(shí)間很長，這在工業(yè)上并不適合。因此對(duì)初選的3種樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖1。

圖1 篩選的3種樹脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)(n=2)

由圖1可見，色素在3種樹脂上的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)相似，均屬于快速平衡型。在吸附初始階段，色素在樹脂上的吸附量隨吸附時(shí)間的延長而快速增加，色素脫除率快速上升，但在125 min左右，樹脂對(duì)色素吸附量增加緩慢，150 min時(shí)3種樹脂對(duì)色素的吸附都基本達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。而在吸附量上，S-8明顯高于其它兩種樹脂。故選擇150 min為3種樹脂對(duì)灰樹花多糖色素的最佳吸附時(shí)間。

2.3 樹脂用量對(duì)樹脂吸附效果的影響 樹脂用量對(duì)灰樹花子實(shí)體酶解液中色素的脫除率和多糖保留率的影響結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 樹脂用量對(duì)灰樹花多糖脫色率的影響(n=2)

由圖2可知，對(duì)于初選的3種樹脂，隨著樹脂用量的增加，色素脫除效果增強(qiáng)，但多糖保留率下降。當(dāng)樹脂用量大于40 g/L料液時(shí)，再繼續(xù)增加樹脂用量，色素脫除率幾乎不再變化。從圖3可以看出，隨著樹脂用量的增加，多糖損失增加，多糖保留率逐漸下降。在樹脂用量相同的情況下，相對(duì)于其它兩種樹脂而言，S-8樹脂的色素脫除率和多糖保留率都明顯高于其它兩種樹脂，在樹脂用量為40 g/L時(shí)，S-8樹脂的脫色率在80%左右，多糖保留率在86%以上。

圖3 樹脂用量對(duì)多糖保留率的影響(n=2)

綜合考慮樹脂對(duì)灰樹花子實(shí)體酶解液脫色率、多糖保留率的影響以及樹脂的吸附動(dòng)力學(xué)，選擇S-8型樹脂為灰樹花子實(shí)體酶解液的脫色樹脂，樹脂用量為40 g濕樹脂/L酶解液，最佳的吸附時(shí)間為150 min。

2.4 吸附溫度對(duì)S-8樹脂吸附效果的影響 吸附溫度對(duì)S-8樹脂吸附效果的影響見圖4。由圖4可以看出，S-8樹脂對(duì)色素的脫除有一個(gè)最適溫度，即40℃時(shí)脫色效果最好。因?yàn)殡S著溫度的升高，色素分子的擴(kuò)散速度加快，多糖溶液黏度下降，有利于色素的吸附。但樹脂對(duì)色素的吸附過程是一個(gè)放熱過程，溫度過高，色素的解吸速度也加快，當(dāng)色素解吸速率大于樹脂對(duì)色素的吸附速率時(shí)，會(huì)導(dǎo)致色素吸附量下降，脫色率降低。同時(shí)，溫度的升高有利于灰樹花多糖中的醇羥基電離，使灰樹花多糖溶液的酸度增加，從而有利于弱堿性樹脂對(duì)其進(jìn)行吸附，因此，隨著溫度的升高，多糖保留率逐漸降低。綜合考慮脫色率和多糖損失率，控制吸附溫度為40℃。

圖4 溫度對(duì)S-8型樹脂脫色率、多糖保留的影響(n=2)

2.5 灰樹花子實(shí)體酶解液的pH對(duì)S-8樹脂吸附效果的影響 灰樹花子實(shí)體酶解液的pH值對(duì)S-8樹脂的脫色率和多糖保留率的影響見圖5。由圖5可以看出，pH值對(duì)多糖的脫色效果和多糖保留率的影響都較大。在中性和弱堿性條件下，樹脂對(duì)色素的吸附效果要好于酸性條件，在pH為7～8時(shí)，色素脫除率在70%以上。說明在中性或弱堿性條件，更有利于色素的脫除，這是因?yàn)榛覙浠ㄗ訉?shí)體酶解液中的大部分色素為弱堿性物質(zhì)，隨著pH增加，色素被釋放出來，游離的分子數(shù)增加，從而加快了樹脂對(duì)色素的吸附。而多糖保留率隨著pH的增大而降低，但在pH為7.0～8.0時(shí)，多糖保留率也在80%左右。因此，S-8型樹脂對(duì)灰樹花子實(shí)體酶解液中色素脫除的最佳使用pH值為7.0～8.0。

圖5 pH值對(duì)灰樹花子實(shí)體酶解液的脫色率、多糖保留率的影響(n=2)

2.6 灰樹花子實(shí)體酶解液的初始多糖濃度對(duì)S-8樹脂吸附效果的影響 灰樹花子實(shí)體酶解液的初始多糖質(zhì)量濃度對(duì)S-8樹脂吸附效果的影響見圖6。從圖6可以看出，在料液質(zhì)量濃度為2.0～6.0 mg/mL的范圍內(nèi)，隨著料液濃度的增大，在同樣條件下，樹脂對(duì)色素的吸附會(huì)逐漸達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)料液質(zhì)量濃度達(dá)到4.0 mg/mL時(shí)，再繼續(xù)增大料液質(zhì)量濃度，脫色率基本保持在70%左右；而當(dāng)料液初始質(zhì)量濃度在2.5～4.0 mg/mL時(shí)，多糖保留率基本保持在85%左右。因此綜合考慮脫色率和多糖保留率的結(jié)果，選擇初始多糖質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL。

圖6 料液的初始質(zhì)量濃度對(duì)多糖保留率、脫色率影響(n=2)

綜合上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，S-8樹脂用于灰樹花子實(shí)體酶解液中色素脫除的較佳工藝參數(shù)為:樹脂用量為40 g濕樹脂/L酶解液，料液初始多糖質(zhì)量濃度控制在4.0 mg/mL，pH 7.0～8.0，吸附溫度40℃，180 r/min振蕩150 min。

2.7 優(yōu)化條件的驗(yàn)證試驗(yàn) 取100 mL初始多糖質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL的灰樹花子實(shí)體酶解液，按照上述優(yōu)化結(jié)果，進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，測定脫色前后多糖含量和溶液吸光度，得到3次實(shí)驗(yàn)的平均色素脫除率為89.5%，RSD為1.97%，平均多糖保留率達(dá)到87.9%，RSD為2.36%。

2.8 樹脂的再生 在利用樹脂進(jìn)行吸附脫色工藝中，樹脂的再生至關(guān)重要。洗脫劑可以使大孔樹脂溶脹，消弱被吸附物質(zhì)與樹脂間的吸附力，從而使被吸附物質(zhì)脫附、溶解。常用的洗脫劑通常包括低級(jí)醇、酮或其水溶液，如甲醇、乙醇、丙醇和丙酮等，考慮食品生產(chǎn)安全性方面的要求，本試驗(yàn)采用乙醇作為洗脫劑，解吸液用量和質(zhì)量濃度對(duì)色素和多糖解吸率的影響結(jié)果見圖7和表3。由圖7可知，隨著乙醇溶液質(zhì)量濃度的增加，乙醇溶液對(duì)色素和多糖的解吸能力均逐漸增強(qiáng)，色素和多糖的解吸率增大，當(dāng)乙醇量達(dá)到30%時(shí)，乙醇對(duì)色素和多糖的解吸能力達(dá)到60%以上，隨著乙醇質(zhì)量濃度的進(jìn)一步增大，解吸率繼續(xù)增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時(shí)，解吸率達(dá)到70%以上。由表3可見，隨著解吸液用量的增加，色素和多糖解吸率都呈上升趨勢，當(dāng)解吸液用量達(dá)到10.0 mL/g濕樹脂時(shí)，色素和多糖的解吸率都在90%以上，大部分被吸附色素和多糖都從樹脂中游離出來，當(dāng)樹脂用量增加到12.5 mL/g濕樹脂時(shí)，色素和多糖解吸率增加不多。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用濃度為30%、用量為10 mL/g濕樹脂作為解吸液，對(duì)樹脂進(jìn)行再生。

圖7 乙醇質(zhì)量濃度對(duì)多糖和色素解吸率的影響(n=2)

表3 解吸液的用量對(duì)色素和多糖解吸率的影響(n=2)

3 結(jié)論

3.1 在篩選的6種大孔樹脂中，S-8樹脂對(duì)灰樹花子實(shí)體酶解液中色素的吸附速率快，色素脫出率高，而對(duì)多糖的吸附較小，多糖保留率較高，是一種較理想的色素吸附劑，可用于脫除灰樹花子實(shí)體酶解液中的色素。

3.2 S-8樹脂用于灰樹花子實(shí)體酶解液中色素的脫除的較佳工藝參數(shù)為:樹脂用量為40 g濕樹脂/L酶解液，料液初始多糖質(zhì)量濃度控制在4.0 mg/mL，pH 7.0～8.0，吸附溫度40℃，180 r/min振蕩150 min。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，根據(jù)優(yōu)化工藝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，色素脫除率達(dá)到89.5%，RSD為1.97%，多糖保留率達(dá)到87.9%，RSD為2.36%。

3.3 采用質(zhì)量濃度為30%、用量為10 mL/g濕樹脂的乙醇作為解吸液，對(duì)樹脂進(jìn)行再生，色素和多糖解吸率都在90%以上。

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