楊 平 林珈好 王玉蓉

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100102

鹽酸小檗堿前體脂質(zhì)體的制備及理化性質(zhì)研究

楊 平 林珈好 王玉蓉▲

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100102

目的 制備鹽酸小檗堿前體脂質(zhì)體，并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行考察。 方法 采用薄膜載體沉積法制備鹽酸小檗堿前體脂質(zhì)體，正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選處方；透射電鏡觀察形態(tài)；馬爾文激光粒度儀測(cè)定粒徑；高效液相色譜法測(cè)定包封率。結(jié)果 電鏡下觀察脂質(zhì)體形態(tài)多為圓形或橢圓形，平均粒徑為741 nm，包封率為 （29.93±1.32）%。 結(jié)論 該方法制備工藝簡(jiǎn)單，易于工業(yè)化生產(chǎn)。

鹽酸小檗堿；前體脂質(zhì)體；脂質(zhì)體

小檗堿（berberine）又稱(chēng)黃連素，常用于治療腸道炎癥?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)它對(duì)于心律失常、高血壓、高脂血癥、糖尿病和腫瘤等也具有較好的治療作用[1]。但由于鹽酸小檗堿口服血藥濃度低，維持時(shí)間短，難以達(dá)到有效的治療濃度，若長(zhǎng)期大劑量給藥，又會(huì)產(chǎn)生諸多不良反應(yīng)。1986年，英國(guó)學(xué)者Payne等[2]首次提出了前體脂質(zhì)體（proliposomes）這一概念，是指將脂質(zhì)材料吸附于水溶性載體上，制備成的干燥顆?；蚍勰?。當(dāng)口服給藥時(shí)，與體液接觸，脂質(zhì)溶脹而載體迅速溶解，在水相中形成脂質(zhì)體，能促進(jìn)藥物的吸收[3]。為解決鹽酸小檗堿吸收差及生物利用度低和普通脂質(zhì)體不穩(wěn)定等問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)首次探討了鹽酸小檗堿前體脂質(zhì)體的制備工藝并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行研究。

1 儀器與試藥

日本島津高效液相色譜儀（LC-20AT四元泵、CTO-10ASVP柱溫箱、SPD-20A紫外檢測(cè)器）；752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上?，F(xiàn)科分光儀器有限公司）； RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；pHS-3C精密酸度計(jì)（上海偉業(yè)儀器廠） ；BSl10S型1/萬(wàn)電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；JEM-1230透射電子顯微鏡（日本電子公司）；Zetasize Nano ZS納米粒度儀（英國(guó)馬爾文）；Olympus CX21 型顯微鏡（日本）。

鹽酸小檗堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110713-200911）；鹽酸小檗堿提取物（四川什邡鴻鳴藥物原料有限公司）；Sephadex G-50 coarse（Pharmacia進(jìn)口分裝）；Lipoid S75天然大豆磷脂（德國(guó)Lipoid公司，純度＞75%）；膽固醇（Amresco分裝）；麥芽糖糊精Maltrin M700（Grain Processing Corporation贈(zèng)樣）；乙腈（色譜純）；其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸小檗堿前體脂質(zhì)體的制備

2.1.1 制備方法 采用薄膜載體沉淀法制備：稱(chēng)取處方量的磷脂、膽固醇及鹽酸小檗堿適量，溶于無(wú)水乙醇中，形成澄明溶液。另取適量麥芽糖糊精（載體）置100 mL圓底燒瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上快速轉(zhuǎn)動(dòng)30 min（40～50℃）至呈流動(dòng)態(tài)，分次向載體粉末中加入上述澄明溶液適量，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。置真空干燥器中干燥過(guò)夜，即得鹽酸小檗堿前體脂質(zhì)體，取出密閉于西林瓶中，置冰箱4℃保存，備用。取前體脂質(zhì)體加適量蒸餾水水合，振搖混合均勻至呈無(wú)不溶性顆粒，即得脂質(zhì)體混懸液。

2.1.2 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 通過(guò)大量預(yù)實(shí)驗(yàn)，初步擬定了鹽酸小檗堿前體脂質(zhì)體的制備工藝。為確定最優(yōu)處方，以包封率為指標(biāo)，以磷脂藥物比（A）、磷脂膽固醇比（B）、載體磷脂比（C）為考察因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，選用L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)表1。方差分析結(jié)果表明，3個(gè)因素對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響均不顯著。故依據(jù)極差分析結(jié)果，確定最優(yōu)水平組合為A2B2C1，即磷脂/藥物為8︰1，磷脂/膽固醇為4︰1，載體/磷脂為2︰1。見(jiàn)表2、3。

表1 因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)表

表3 方差分析表

2.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按篩選的處方和工藝制備前體脂質(zhì)體，測(cè)得其包封率為（29.93±1.32）%。

2.2 鹽酸小檗堿前體脂質(zhì)體包封率的測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈 -0.033 mol/L KH2PO4（35∶ 65），用H3PO4調(diào)至pH3.2；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：345 nm，進(jìn)樣 10 μL。

2.2.2 線性關(guān)系的考察 精密稱(chēng)取鹽酸小檗堿對(duì)照品10 mg，用甲醇溶解定容于50 mL量瓶中，得0.2 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密量取儲(chǔ)備液適量，分別稀釋成 0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定。以峰面積（y）對(duì)樣品濃度（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：y=43 728x+382.68，R2=0.999 9，表明鹽酸小檗堿在0.2～8.0μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 精密量取鹽酸小檗堿對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用蒸餾水稀釋至濃度為2.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。重復(fù)進(jìn)樣5次，平均峰面積為885 14，RSD為0.41%。結(jié)果表明該方法精密度良好，符合要求。

2.2.4 回收率試驗(yàn) 精密量取9份空白脂質(zhì)體混懸液0.5 ～ 10 mL量瓶中，分別加入3個(gè)濃度的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度3份，加入體積分?jǐn)?shù)為 10% 的 Triton X-100乙醇溶液1 mL后，加蒸餾水定容至刻度，搖勻即得濃度為0.8、2.0、8.0 μg/mL的樣品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。低、中、高3種濃度的回收率分別為97.7%、98.2%和99.9%，RSD分別為1.92%、0.79%和0.19%（n=3），表明本方法回收率符合要求。2.2.5 包封率測(cè)定方法 取1.5g Sephadex G-50濕法裝于0.8 cm×20 cm層析柱，用 PBS緩沖液平衡。精密移取鹽酸小檗堿脂質(zhì)體混懸液0.20 mL上樣，PBS洗脫，流速1.0 mL/min。收集前9 mL洗脫液為脂質(zhì)體部分，后10～30 mL為游離藥物部分。游離部分用PBS緩沖液定容至25 mL量瓶中。按2.2.1項(xiàng)下方法測(cè)定鹽酸小檗堿含量，即為脂質(zhì)體中未包封的游離藥物量。另取鹽酸小檗堿脂質(zhì)體混懸液0.2 mL于25 mL量瓶中，操作同前，HPLC測(cè)定鹽酸小檗堿含量，此為總藥量，按公式計(jì)算包封率：包封率（EE%）=（1-W游/W總）×100%（注：W總為鹽酸小檗堿總藥量，W游為脂質(zhì)體中未包封的游離藥物量）。

2.3 鹽酸小檗堿前體脂質(zhì)體理化性質(zhì)的研究

2.3.1 前體脂質(zhì)體粉末的理化性質(zhì) 外觀：前體鹽酸小檗堿脂質(zhì)體為均一、流動(dòng)性較好的黃色顆粒。休止角的測(cè)定：采用漏斗法測(cè)定。測(cè)得休止角均值為34.8°，均小于40°，表明流動(dòng)性良好。

2.3.2 水合后脂質(zhì)體的理化性質(zhì) 光學(xué)顯微鏡觀察：吸取一滴水合后的脂質(zhì)體混懸液至載玻片上，置光學(xué)顯微下觀察。結(jié)果顯示脂質(zhì)體大小形態(tài)均一。見(jiàn)圖1。電子顯微鏡鏡觀察：取少量脂質(zhì)體滴至載玻片上，用1%磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染，再滴至專(zhuān)用銅網(wǎng)上，自然揮干，使粒子在銅網(wǎng)上濃縮沉積，用電子顯微鏡觀察并拍攝照片。結(jié)果顯示脂質(zhì)體形態(tài)多為圓形或橢圓形，明顯可見(jiàn)雙分子層結(jié)構(gòu)。見(jiàn)圖2。脂質(zhì)體粒徑的測(cè)定：取鹽酸小檗堿前體脂質(zhì)體混懸液適量，用生理鹽水稀釋至適宜濃度，以動(dòng)態(tài)光散射激光粒度電位測(cè)定儀測(cè)定脂質(zhì)體的粒徑大小與分布，將樣品溶液加至四通比色皿的1.0 ～ 1.5 mL處，放入樣品測(cè)定池中。選擇測(cè)定參數(shù)，進(jìn)行粒度測(cè)定，平均粒徑為741 nm，分散系數(shù)為0.214。見(jiàn)圖3。

圖1 鹽酸小檗堿脂質(zhì)體顯微照片（40×10）

圖2 鹽酸小檗堿脂質(zhì)體透射電鏡 照片（×200 00）

圖3 Zetasizer Nano ZS納米粒度儀測(cè)定結(jié)果

3 討論

本研究選擇載體沉淀法制備前體脂質(zhì)體，曾考察山梨醇、甘露醇、葡萄糖、β-環(huán)糊精、氯化鈉、麥芽糖糊精作為載體，結(jié)果顯示采用麥芽糖糊精不僅外觀較好，且負(fù)載量較大，包封率也相對(duì)較高，故確定采用麥芽糖糊精為載體。

前體脂質(zhì)體的制備方法一般對(duì)于脂溶性藥物包封率較高，可達(dá)90%以上，如尼莫地平為95%[4]，而對(duì)于水溶性和難溶性藥物包封率普遍較低，如鹽酸普奈洛爾前體脂質(zhì)體水化后的包封率僅為10%[5]，利巴韋林為28%[6]，葛根素為43.53%[7]等。由于鹽酸小檗堿為強(qiáng)酸強(qiáng)堿鹽，水溶性脂溶性均不好，可能是導(dǎo)致包封率較低的主要原因。但是本研究首次嘗試將鹽酸小檗堿制成口服前體脂質(zhì)體，成功解決了液體脂質(zhì)體不穩(wěn)定的問(wèn)題，且制法簡(jiǎn)便、適于工業(yè)化生產(chǎn)，為鹽酸小檗堿治療其他疾病拓寬了劑型研究途徑。鹽酸小檗堿前體脂質(zhì)體動(dòng)物體內(nèi)的吸收和生物利用度研究正在進(jìn)行中。

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Preparation of berberine hydrochloride prolipsomes and study of its physicochemical properties

YANG Ping LIN Jiahao WANG Yurong
School of Chinese Pharmacy,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China

ObjectiveTo prepare berberine hydrochloride proliposomes and investigate its physicochemical properties.MethodsProliposomes were prepared by film-deposition oncarriers. Orthogonal design was used to select the optimum formulation. The shape and particle size of proliposomes were investigated by transmission electron microscope and laser scatter. The encapsulation efficiency was determined by HPLC.ResultsThe berberine hydrochloride liposome vesicles were globular or elliptic under the electronic microscopy. The average size of the liposomes was 741nm. The encapsulation efficiency was(29.93±1.32)%.ConclusionThe preparation method is simple and easily industrialized preparation .

Berberine hydrochloride;Proliposomes;Liposomes

TQ43.2

B

2095-0616（2012）02-32-03

▲通訊作者

2011-11-25）