丁 宇，阮狄克，何 勍，王超鋒

鑒于脊柱融合術(shù)后易導(dǎo)致鄰近節(jié)段的退變，異體椎間盤移植(total disc allografting，TDA)等椎間關(guān)節(jié)成形術(shù)近年來(lái)得以快速發(fā)展，系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及一期臨床研究均證實(shí)了TDA 作為自然生物椎間盤移植的有效性［1-2］。然而，異體組織材料在臨床的應(yīng)用過(guò)程中還應(yīng)考慮到其安全性，即盡量減少諸如肝炎、HIV 等病毒，細(xì)菌或真菌等所致疾病傳播的可能性。另外，隨著椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)生物學(xué)治療的發(fā)展，諸如組織工程構(gòu)建椎間盤、基因治療、間充質(zhì)干細(xì)胞移植等均具有令人鼓舞的應(yīng)用前景［3-4］，人們期望找到一種可靠的生物支架用于椎間盤疾病的相關(guān)研究。本研究通過(guò)比格犬動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，旨在評(píng)價(jià)經(jīng)γ 射線照射致去細(xì)胞化異體椎間盤的生物學(xué)特性，進(jìn)而探討其作為生物椎間盤支架的可行性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

共選擇6 只比格犬，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案事先得到醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)道德委員會(huì)批準(zhǔn)。所有犬實(shí)驗(yàn)前均行X線檢查，以排除脊柱疾患的可能。應(yīng)用超劑量戊巴比妥鈉(1 mL/kg)靜脈注射處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并獲取盡可能長(zhǎng)的脊柱節(jié)段。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

胸腰椎脊柱節(jié)段被分解并隨機(jī)分為4組:1 個(gè)對(duì)照組(椎間盤未被照射處理)及3 個(gè)處理組(不同劑量射線照射處理)。每組含有12 個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本，其中6 個(gè)樣本用于細(xì)胞活性檢測(cè)(主要為胸椎)，另外6 個(gè)樣本用于生物力學(xué)測(cè)試(主要為腰椎)。射線照射劑量分為18 kGy，25 kGy 及50 kGy 3 個(gè)等級(jí)，照射完畢后各實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本立即送往細(xì)胞檢測(cè)，并盡早行生物力學(xué)測(cè)試。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 椎間盤準(zhǔn)備及冷凍

盡量去除脊柱標(biāo)本周圍的肌肉、韌帶等附著組織，分別于距離上下終板1～2 mm 處截?cái)嘧刁w，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不斷用0.9%生理鹽水噴灑標(biāo)本以保持其濕度。實(shí)驗(yàn)中采用逐級(jí)冷度的方法進(jìn)行標(biāo)本處理，首先將獲取的椎間盤標(biāo)本用生理鹽水洗凈，然后浸于RPMI-1640 冷凍保存液中(10% 二甲基亞砜+10%小牛血清)，處理后標(biāo)本冷藏于4℃冰箱中。繼而，標(biāo)本保存在－15℃環(huán)境中1 h、－40℃環(huán)境中1 h，最終儲(chǔ)存于－80℃低溫冰柜中3周。

1.3.2 射線輻射

椎間盤接受60Co 源照射(北京大學(xué)鈷源控制中心)，標(biāo)本周圍放置干冰以保持低溫環(huán)境，控制照射劑量分別為18 kGy，25 kGy 及50 kGy。在照射過(guò)程中，將標(biāo)本袋置于照射空間中心位置，以保證整個(gè)標(biāo)本接受均勻強(qiáng)度的射線輻射處理，輻射量計(jì)放置于標(biāo)本附近以檢測(cè)實(shí)際輻射劑量。

1.3.3 移植椎間盤細(xì)胞活性的檢測(cè)

用于細(xì)胞活性檢測(cè)的椎間盤組織應(yīng)及時(shí)嚴(yán)密包裝，并于0.5 h 內(nèi)送往檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。將凍存管直接浸泡于37℃水浴中復(fù)溫(復(fù)溫速率約100 ℃/min)，取出椎間盤組織，冰凍切片厚度30 μm。加入5 mg/L的溴化乙錠(ethylene dibromide，EB)和50 mg/L的二醋酸熒光素(fluoresceindiacetate，F(xiàn)DA)各20 μL，加蓋玻片，放入37℃恒溫箱中避光孵育10 min，然后在熒光顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞膜的完整性。胞膜完整的髓核細(xì)胞將被FDA 染為綠色，胞膜破裂的髓核細(xì)胞被EB 染為橙色，計(jì)數(shù)每0.01 mm內(nèi)綠染及橙染的細(xì)胞數(shù)，髓核細(xì)胞存活率為綠染細(xì)胞數(shù)/(綠染細(xì)胞數(shù)+橙染細(xì)胞數(shù))。由于椎間盤組織包括纖維環(huán)及髓核，因此計(jì)數(shù)時(shí)將纖維環(huán)分為2 部分，即外側(cè)纖維和與髓核相接的內(nèi)層纖維環(huán)，每部分各計(jì)數(shù)5 個(gè)視野，取均數(shù)，髓核組織亦選取5 個(gè)視野計(jì)數(shù)。每一計(jì)數(shù)結(jié)果需通過(guò)肉眼觀察驗(yàn)證，以盡可能減少由于“過(guò)度自動(dòng)”檢測(cè)所致讀數(shù)偏差。另外，同時(shí)兼具綠染及橙染的細(xì)胞被視為活細(xì)胞。

1.3.4 生物力學(xué)測(cè)試

測(cè)試標(biāo)本密封冷凍于－30℃冰柜里，測(cè)試前12 h置于室溫融解。用特制尖頭螺釘穿透椎間盤上下椎體，將標(biāo)本固定于MTS 機(jī)(MTS 858 Mini BionixⅡ，Eden Prairie)測(cè)試夾具上，在動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)采集系統(tǒng)軟件的輔助下進(jìn)行相關(guān)測(cè)試。根據(jù)椎間盤本身的生物學(xué)特性，設(shè)計(jì)測(cè)試不同實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本的機(jī)械強(qiáng)度及彈性變形能力并進(jìn)行比較。首先，軸向位移設(shè)定為1 mm，予以測(cè)試標(biāo)本縱向牽拉力及壓應(yīng)力;然后分別予以標(biāo)本左/右5°旋轉(zhuǎn)，測(cè)試其扭力矩(見(jiàn)圖1)。每一次測(cè)試過(guò)程中取最大參數(shù)值。為盡可能減少系統(tǒng)誤差，隨機(jī)安排予以標(biāo)本牽拉、壓應(yīng)力測(cè)試順序及左/右旋轉(zhuǎn)測(cè)試順序，每一標(biāo)本分別予以3 次完整測(cè)試，比較分析不同測(cè)試結(jié)果間的差異性，并取其平均值。在測(cè)試過(guò)程中不斷噴灑0.9%生理鹽水以維持標(biāo)本的濕度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差分析用以驗(yàn)證不同實(shí)驗(yàn)組變量的差異，各組統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以±s 表示。為減少個(gè)體差異及系統(tǒng)誤差，細(xì)胞活性測(cè)試結(jié)果以百分比表示。應(yīng)用非參數(shù)檢驗(yàn)方法，Wilcoxon 秩檢驗(yàn)用以比較2組間的統(tǒng)計(jì)差異，Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)用以2組以上的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。成對(duì)資料的t 檢驗(yàn)用以同組間不同時(shí)段數(shù)據(jù)的分析比較。統(tǒng)計(jì)學(xué)水平取α=0.05。

2 結(jié) 果

熒光顯微鏡下各組椎間盤內(nèi)細(xì)胞活性檢測(cè)情況見(jiàn)圖2。對(duì)照組纖維環(huán)及髓核細(xì)胞活性分別為92.6%、90.7%，18 kGy 照射組為76.5%、70.6%，25 kGy照射組為48.9%、50.7%，50 kGy 照射組為18.3%、10.1%(見(jiàn)表1，圖3)。與對(duì)照組比較，所有照射組椎間盤纖維環(huán)及髓核的細(xì)胞活性均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);同時(shí)各處理組間細(xì)胞活性亦有明顯差別，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，提示椎間盤接受γ 射線照射劑量與細(xì)胞活性水平呈負(fù)相關(guān)。

圖1 椎間盤相關(guān)參數(shù)生物力學(xué)測(cè)試Fig.1 Biomechanical test analysis for Intervertebral disc

圖2 熒光顯微鏡下觀察椎間盤細(xì)胞活性(×200)Fig.2 Disc cell viability detected by fluorescence microscop(×200)

表1 各組椎間盤內(nèi)細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Cell viability in intervertebral disc of different groups

椎間盤施以縱向拉/壓及左/右旋轉(zhuǎn)位移運(yùn)動(dòng)后，測(cè)試標(biāo)本未見(jiàn)解剖結(jié)構(gòu)破壞，同一標(biāo)本多次測(cè)試結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示相關(guān)參數(shù)設(shè)置合理。生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示γ 射線照射后椎間盤的生物力學(xué)特性未見(jiàn)明顯改變，各組間相應(yīng)受力及扭力矩最大值均無(wú)明顯差別，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，相應(yīng)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)及分析見(jiàn)表2。

圖3 各實(shí)驗(yàn)組椎間盤細(xì)胞活性Fig.3 Cell viability in intervertebral disc treated with various doses of Gamma irradiation

3 討 論

3.1 本研究的意義及特點(diǎn)

作為一種保留手術(shù)節(jié)段活動(dòng)度的手術(shù)方式，椎間關(guān)節(jié)成形術(shù)避免了由既往融合術(shù)所致鄰近節(jié)段的應(yīng)力集中，從而避免了(至少是減低了)這些節(jié)段椎間盤退變加速的可能［5］。同人工椎間盤置換一樣，異體椎間盤移植旨在重建椎間盤切除術(shù)后的脊柱穩(wěn)定性、恢復(fù)節(jié)段活動(dòng)度，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床一期研究均證實(shí)了異體椎間盤移植的可行性［1-2］。異體椎間盤在一定程度上模擬正常椎間盤的生物力學(xué)狀態(tài)、動(dòng)力學(xué)應(yīng)力狀態(tài)及生理功能，具有良好的解剖學(xué)適配性、能夠承受并傳導(dǎo)正常的軸向擠壓及扭轉(zhuǎn)等生物力學(xué)應(yīng)力。

異體組織器官移植的風(fēng)險(xiǎn)之一是傳播相關(guān)疾病，如HIV、丙肝及乙肝等，盡管組織移植材料在處理、保存及運(yùn)輸方面都是嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則的，但并不能完全消除這些處理過(guò)程中移植物被細(xì)菌或病毒污染的可能。因此異體組織庫(kù)在處理骨肌肉移植材料時(shí)，除常規(guī)消毒滅菌處理及無(wú)菌操作外還使用(如γ 射線)照射等追加的保險(xiǎn)措施，以期獲得更高的安全性［6］。對(duì)異體移植物可能傳播HIV 等疾病的顧慮也使γ 射線的應(yīng)用日益普遍，它能夠較理想地覆蓋穿透移植物內(nèi)所有組織結(jié)構(gòu)，同時(shí)也是一種相對(duì)經(jīng)濟(jì)的方法。但是，有報(bào)道稱在γ 射線消毒滅菌減少移植物傳播疾病的同時(shí)，組織的生物學(xué)性能也可能會(huì)受到一定程度的影響［7］。

本研究的特點(diǎn)在于:①評(píng)價(jià)了經(jīng)γ 射線照射處理后椎間盤的生物學(xué)性能。②成功制作了椎間盤自然支架模型，選擇適宜的γ 射線輻射強(qiáng)度，使得椎間盤去細(xì)胞化的同時(shí)保留了組織生物力學(xué)性能，初步證實(shí)了去細(xì)胞化椎間盤作為自然支架應(yīng)用于椎間盤疾病相關(guān)研究的可行性。

3.2 低溫條件下異體椎間盤的保存和γ 射線照射處理過(guò)程

椎間盤移植過(guò)程中如何保持異體椎間盤細(xì)胞活性是一個(gè)棘手的問(wèn)題。低溫保存常被用于保護(hù)組織細(xì)胞，因?yàn)榭焖俚睦鋬鰰?huì)增加細(xì)胞內(nèi)液的濃度及粘性，從而有助于保存細(xì)胞內(nèi)水分、防止細(xì)胞快速皺縮［8］。低溫保存前通常在4℃以下的10%的二甲基亞砜溶液中浸泡1～2 h，而后經(jīng)過(guò)2 次冷卻處理最終達(dá)到－80℃(有條件時(shí)再次冷凍保存至－196℃超低溫環(huán)境)。應(yīng)用逐級(jí)冷凍技術(shù)，可以使得椎間盤內(nèi)細(xì)胞活性保持至24 個(gè)月，同時(shí)它的機(jī)械性能和穩(wěn)定性都沒(méi)有發(fā)生明顯變化［9］。

電離輻射對(duì)組織及其他生物制劑的損傷機(jī)制主要包括直接作用和間接作用。直接作用是離子在遇到組織后發(fā)生共價(jià)鍵的斷裂及外層電子的躍遷，從而直接釋放出能量，造成組織的損傷。間接作用是γ 射線作用于水分子、氧氣等產(chǎn)生自由基及活性氧等，作用于靶分子并對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)造成不可逆損害，其中以O(shè)H-的破壞作用尤為突出;盡管自由基和活性氧只能存在較短的時(shí)間，但是它們具有極強(qiáng)的活性，大多數(shù)組織損傷都是由它們所造成的［10］。在低溫環(huán)境下，產(chǎn)生的自由基數(shù)目相對(duì)較少，因此對(duì)組織造成的損傷也較少。本實(shí)驗(yàn)中，低溫冷凍環(huán)境有利于保護(hù)椎間盤內(nèi)的組織細(xì)胞，同時(shí)優(yōu)化了γ 射線照射環(huán)境、減輕了對(duì)組織的損害。

表2 椎間盤體外生物力學(xué)測(cè)試結(jié)果Tab.2 Biomechanical test results of intervertebral disc

3.3 γ 射線照射處理椎間盤的細(xì)胞活性

椎間盤是由纖維環(huán)、髓核、軟骨終板高度整合構(gòu)成的異質(zhì)體，最終它們作為一個(gè)高度整合的整體賦予了椎間盤在機(jī)體中獨(dú)特的力學(xué)特性和生物學(xué)功能［11］。在尚未退變的椎間盤里，髓核是一個(gè)富含水、黏多糖、膠原及非膠原蛋白的有光澤的膠凍狀結(jié)構(gòu);纖維環(huán)是一個(gè)有纖維軟骨基質(zhì)構(gòu)成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中纖維與脊柱橫截面成角28°～43°;上下軟骨終板對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸及代謝廢物的清除起了至關(guān)重要的作用，同時(shí)由于軟骨終板的多孔性及可滲透性，它們對(duì)液體的散布也起到了一定作用。

纖維環(huán)細(xì)胞起源于間充質(zhì)，但是它同時(shí)也顯示了一些纖維母細(xì)胞及軟骨細(xì)胞的特性，例如它可以分泌Ⅰ型、Ⅱ型膠原，合成蛋白多糖。而越靠近內(nèi)側(cè)的纖維環(huán)，纖維環(huán)里的細(xì)胞越圓，細(xì)胞數(shù)量越少，纖維環(huán)細(xì)胞往往被富含Ⅲ型、Ⅳ型膠原的軟骨基質(zhì)所圍繞。在早期的胚胎發(fā)育過(guò)程中，椎間盤的環(huán)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)外部分在細(xì)胞構(gòu)成和形態(tài)方面有著顯著的不同，環(huán)的外側(cè)是一層層變成長(zhǎng)形的細(xì)胞構(gòu)成的，而內(nèi)層細(xì)胞仍呈圓形的、軟骨樣細(xì)胞，沒(méi)有形成層狀結(jié)構(gòu)，但是合成了大量的細(xì)胞外基質(zhì)。髓核是從脊索分化而來(lái)的，在早期胚胎里，脊索來(lái)源的髓核細(xì)胞聚集在一起，細(xì)胞之間有縫隙連接，共同分泌一種半透明的、與成熟椎間盤不一樣的基質(zhì)，最終脊索細(xì)胞逐漸被圓形的、包埋在基質(zhì)內(nèi)的軟骨樣細(xì)胞所代替。

細(xì)胞活性水平取決于存活細(xì)胞和死亡細(xì)胞間的比例。研究顯示，γ 射線對(duì)組織的損傷程度與照射劑量及照射時(shí)組織的物理狀態(tài)有關(guān)。新鮮冷凍保存椎間盤后，纖維環(huán)及髓核內(nèi)仍能保證有＞90%的細(xì)胞存活［9］。但經(jīng)γ 射線照射后，存活細(xì)胞比例迅速減小，其中接受高劑量照射的椎間盤內(nèi)存活細(xì)胞數(shù)量明顯小于接受低劑量照射組。低劑量γ 射線照射的椎間盤內(nèi)保留了較多存活的細(xì)胞，故而期望該組椎間盤移植后能夠更好地承擔(dān)生物學(xué)功能。盡管之前針對(duì)異體骨的實(shí)驗(yàn)建議首選中等照射劑量［12］，但是很難確定具有較低細(xì)胞活性的椎間盤能否承擔(dān)理想的生物學(xué)功能，而接受高劑量照射的椎間盤可能更加難以完成最基本的生物學(xué)活動(dòng)。

3.4 γ 射線照射對(duì)椎間盤機(jī)械性能的影響

對(duì)骨骼肌肉移植材料的消毒滅菌處理仍是一個(gè)極大的挑戰(zhàn)，γ 射線應(yīng)該能夠穿透整個(gè)移植材料，在殺滅可能攜帶的病原微生物的同時(shí)，盡量保持異體組織生物學(xué)及機(jī)械性能。與椎間盤相類似，一些學(xué)者研究了γ 射線對(duì)肌腱、骨以及骨-肌腱-骨復(fù)合體生物力學(xué)特性的影響?？傮w來(lái)說(shuō)，20 kGy 的放射劑量對(duì)所有類型的異體移植物都是安全可行的，對(duì)組織的機(jī)械性能不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷。對(duì)醫(yī)用材料來(lái)講，通常＜20 kGy 的照射劑量就足以達(dá)到滅菌消毒目的，在20 kGy γ 射線作用下，大多數(shù)對(duì)射線敏感的細(xì)菌病毒(包括HIV 病毒)都能夠被殺滅［13］。但為保險(xiǎn)起見(jiàn)，國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)(international atomic energy agency，IAEA)推薦25 kGy 作為醫(yī)用材料消毒滅菌的標(biāo)準(zhǔn)劑量，而大多數(shù)商業(yè)性異體組織庫(kù)建議使用15～20 kGy 的照射劑量進(jìn)行消毒滅菌。Vangsness 等［14］對(duì)36 家組織庫(kù)的一項(xiàng)調(diào)查顯示，大多組織庫(kù)選擇10～35 kGy 不等的γ 射線劑量。Fideler等［15］針對(duì)骨肌腱移植材料的研究顯示，往往需要40 kGy 的照射強(qiáng)度才可能殺滅HIV、甲肝、丙肝及其他病毒微生物。而Grieb 等［16］建議的照射劑量高達(dá)50 kGy，單位面積內(nèi)可以殺滅16 log10 耐藥微生物、＞4.5 log10 辛德比斯病毒及4.9 log10 細(xì)小病毒。

選擇合適的異體椎間盤應(yīng)考慮到其初始的機(jī)械性能和植入后對(duì)應(yīng)力的承受能力。本實(shí)驗(yàn)顯示，各處理組與對(duì)照組椎間盤的生物力學(xué)特性是一致的，這是進(jìn)行椎間盤體內(nèi)移植的先決條件。經(jīng)γ 射線處理的椎間盤能夠較好地保持原有的機(jī)械性能及生物學(xué)特性，這無(wú)疑將為異體椎間盤提供一個(gè)全新的消毒滅菌方法。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)評(píng)估了經(jīng)γ射線處理的椎間盤的生物力學(xué)特性的變化，研究顯示椎間盤在高達(dá)50 kGy 劑量(接近于常規(guī)劑量的3倍)照射后仍展現(xiàn)了良好的生物力學(xué)性能，在采取優(yōu)化照射措施的前提下，達(dá)到消毒滅菌效果的同時(shí)對(duì)組織的傷害程度相對(duì)較小。

3.5 展望

目前，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者都在試圖找到一種修復(fù)退變性椎間盤的方法，提出了諸如基因治療、生長(zhǎng)因子注射、以細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程及細(xì)胞治療等多種療法?？紤]到包括蛋白多糖及膠原等基質(zhì)的減少為椎間盤退變的主要始動(dòng)因素，研究人員通過(guò)植入能夠產(chǎn)生基質(zhì)的細(xì)胞來(lái)修復(fù)退變性椎間盤，即所謂的細(xì)胞治療方法［17］。目前應(yīng)用的細(xì)胞主要包括脊索髓核細(xì)胞、自體椎間盤軟骨細(xì)胞、彈性軟骨或肋軟骨以及間充質(zhì)干細(xì)胞等，實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人振奮，從中看到了可以延緩椎間盤退行性變甚至重塑椎間盤組織的可能性。但是，還有一些問(wèn)題亟待解決，包括如何建立可靠的椎間盤移植動(dòng)物模型、細(xì)胞植入的最佳干預(yù)時(shí)機(jī)等。

適當(dāng)劑量的γ 射線照射處理椎間盤，其內(nèi)細(xì)胞活性仍可保持在一定的水平，同時(shí)無(wú)明顯生物力學(xué)等機(jī)械性能的降低，提示經(jīng)照射處理的異體椎間盤有可能作為自然支架為纖維環(huán)及髓核細(xì)胞的增殖提供理想的生理環(huán)境。但是，除了自由基的直接損害作用外，γ 射線還可造成對(duì)遺傳物質(zhì)核糖核酸的損傷，導(dǎo)致相關(guān)基因組的損傷及功能障礙，進(jìn)而影響到體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中活性細(xì)胞的作用表達(dá)。因此，經(jīng)γ 射線照射后異體椎間盤應(yīng)用的確切效果有待體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確。一方面需要觀察不同劑量照射處理的椎間盤移植后的生物學(xué)轉(zhuǎn)歸，即能否維持椎間盤高度及穩(wěn)定性、能否保持手術(shù)節(jié)段的功能及活動(dòng)度;另一方面需要進(jìn)一步探討自然椎間盤支架在椎間盤疾病相關(guān)研究中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，如去細(xì)胞化椎間盤能否為特定細(xì)胞提供理想的生存增殖環(huán)境。

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