2，4-D和6-BA對高羊茅愈傷組織誘導的影響

，

(湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，長沙 410128)

2012-10-16

武羿君(1988—)，女，內(nèi)蒙古呼和浩特人。*通訊作者，Email：huxu0309@yahoo.com.cn。

湖南農(nóng)業(yè)大學大學生研究性學習和創(chuàng)新性實驗計劃項目(XCX1019)；中國科學院植物種質(zhì)創(chuàng)新與特色農(nóng)業(yè)重點實驗室開放課題(Y052811t04)；湖南省教育廳項目(KC2011B023)。

2，4-D和6-BA對高羊茅愈傷組織誘導的影響

武羿君，徐慶國*

(湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，長沙 410128)

以高羊茅成熟種子為外植體，采用MS 基本培養(yǎng)基，研究了不同濃度的2,4-D和6-BA對其愈傷組織誘導的影響。結(jié)果表明：不同濃度2,4-D對高羊茅愈傷組織誘導率差異顯著，以9 mg/ L效果最好，濃度過高，愈傷組織誘導率下降；在0～0.8 mg/ L范圍內(nèi)，高羊茅愈傷組織誘導率隨6-BA 濃度的增加而增大，當濃度為0.6 mg/L時誘導效果最好。

高羊茅；組織培養(yǎng)；愈傷組織；2,4-二氯苯氧乙酸；6-芐氨基嘌呤

高羊茅又稱葦狀羊茅，禾本科羊茅屬，原產(chǎn)歐洲西部，具有較高的營養(yǎng)價值，是溫帶地區(qū)建立人工草地和補播天然草場的重要草種[1]。高羊茅屬多年生冷季型草種，具有抗干旱、耐瘠薄、抗病性強、耐粗放管理、適應性廣及綠期長、觀賞性高等特點，因此，廣泛應用于世界各國的綠地建設(shè)和水土保持等各類草坪中[2]。高羊茅作為一種重要草種，不僅廣泛應用于內(nèi)蒙古、新疆、甘肅、黑龍江等我國北方省市的牧場草地和綠化草坪建植中，在我國南方草坪過渡性地帶的常綠草坪建植中也發(fā)揮著重大作用，是我國目前較為常用的冷季型草坪草種之一[3～5]。

國外發(fā)達國家對草坪草育種的研究歷史較長，早已開展了對高羊茅的轉(zhuǎn)基因研究，并獲得了轉(zhuǎn)基因工程植株，實現(xiàn)了對高羊茅性狀的定向改良[6]。國內(nèi)對草坪草植株再生體系的研究開展較晚，直到20世紀90年代隨著草坪業(yè)的快速發(fā)展才得以起步研究。與其他重要的禾本科作物相比，國內(nèi)關(guān)于高羊茅的組織培養(yǎng)研究遠遠落后，而成功建立高羊茅再生植株的報道更為少見[7]。國內(nèi)雖然也對高羊茅的組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因進行了一些研究，但其研究深度和廣度還遠遠不夠。一般認為愈傷組織是轉(zhuǎn)基因的理想受體，要對草坪草進行遺傳轉(zhuǎn)化，首先要建立其愈傷組織再生體系，而愈傷組織的誘導是建立再生體系的前提和基礎(chǔ)[8～10]。國內(nèi)對高羊茅愈傷組織的誘導曾有不少研究，認為不同濃度的2,4-D和6-BA對高羊茅愈傷組織誘導有重要影響，對高羊茅再生體系的建立和轉(zhuǎn)基因育種具有十分重要的意義。本研究選取不同品種高羊茅成熟種子為外植體，研究不同濃度的2，4-D和6-BA對高羊茅愈傷組織誘導的影響，試圖找到能產(chǎn)生高羊茅愈傷組織高出愈率的2,4-D和6-BA最佳濃度，建立適宜的高羊茅再生體系，為高羊茅的轉(zhuǎn)基因育種建立基礎(chǔ)和提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試高羊茅品種

北京百綠(天津)國際草業(yè)有限公提供的3個高羊茅(Festucaarundinacea)品種：交戰(zhàn)Ⅱ(Crossfire Ⅱ)、貝克(Baker)、獵狗(Hound)。

1.2 外植體處理方法

分別取各供試高羊茅品種成熟種子，在50 %的硫酸中浸泡30 min，脫去穎殼后用清水洗凈，去掉雜質(zhì)，再用清水浸泡12 h，清水沖洗后置于4℃環(huán)境下備用。

1.3 試驗方法

按MS配方配置MS培養(yǎng)基作為本研究的基本培養(yǎng)基。在MS基本培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的6-BA和2,4-D，各種處理培養(yǎng)基pH值均調(diào)至5.8，分別設(shè)置如下2種不同激素濃度的單因素試驗。

(1)在MS培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的2,4-D，作為高羊茅愈傷組織的誘導培養(yǎng)基。2,4-D 濃度分別為0、3、6、9和12 mg/L，以未加2,4-D的MS培養(yǎng)基為對照。每種處理分別接種30粒不同高羊茅品種種子，每個培養(yǎng)基組合設(shè)置3個重復，共計5組，每組9個處理。

(2)在MS培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的6-BA，作為3個高羊茅品種愈傷組織的誘導培養(yǎng)基。6-BA濃度分別為0、0.2、0.4、0.6和0.8 mg/L，以未加6-BA的MS培養(yǎng)基為對照。每種處理分別接種30粒不同高羊茅品種種子，每個培養(yǎng)基組合設(shè)置3個重復，共計5組，每組9個處理。

1.4 接種

在超凈工作臺上，將已經(jīng)過處理的高羊茅種子分別用70%的酒精消毒30～40 s， 用無菌水沖洗3～5次，再用0.1%升汞(氯化汞)溶液處理3～4 min后用無菌水沖洗4～5次。將經(jīng)過消毒處理的3個不同高羊茅品種的種子接種到不同培養(yǎng)基組合，置于25～26℃，暗培養(yǎng)條件下進行愈傷組織誘導培養(yǎng)。

1.5 愈傷組織觀察及記錄

不同品種的高羊茅種子接種7 d后開始統(tǒng)計不同處理組合的發(fā)芽率、出愈率，每隔5 d統(tǒng)計1次。按如下公式統(tǒng)計各處理的發(fā)芽率、出愈率：

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽種子數(shù)/接種數(shù)×100

出愈率(%)=不再變化后愈傷數(shù)/接種數(shù)×100

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本研究所有統(tǒng)計分析工作采用Excel統(tǒng)計分析軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同2,4-D濃度對高羊茅愈傷組織誘導的影響

由表1可知，不同濃度的2,4-D對高羊茅的發(fā)芽率影響不顯著，且高羊茅的發(fā)芽率對其愈傷組織的出愈率影響也不明顯。最終發(fā)芽率的統(tǒng)計結(jié)果表明，不同高羊茅品種的發(fā)芽率與2,4-D的濃度不存在顯著相關(guān)，與其出愈率的相關(guān)也未達顯著水平。

不同2,4-D濃度培養(yǎng)基接種的高羊茅種子在暗培養(yǎng)7 d后，大部分種子在芽鞘和種子連接處產(chǎn)生了白色水浸狀、柔軟松散的物質(zhì)；在連續(xù)培養(yǎng)20 d后，愈傷組織的顏色由白色透明轉(zhuǎn)變?yōu)榘胪该鞯S色。40 d后統(tǒng)計不同處理的愈傷組織誘導結(jié)果，表明不同濃度的2,4-D對高羊茅愈傷組織的誘導率影響不同。在5種2,4-D處理濃度中，處理濃度為9 mg/L的出愈率為43%，極顯著高于其他處理濃度的出愈率；2,4-D濃度為6 mg/L的出愈率極顯著高于濃度為3 mg/L和12 mg/L的出愈率(表1)。由此可知，在一定的濃度范圍內(nèi)，2,4-D能夠提高高羊茅愈傷組織的出愈率，但濃度過高反而會降低高羊茅愈傷組織的出愈率，其中以添加2,4-D 9 mg/L的MS培養(yǎng)基對高羊茅成熟種子的愈傷組織誘導效果最好。

表1 不同2，4-D濃度處理的高羊茅種子發(fā)芽率與出愈率

注：表中同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示α= 0. 05 水平上差異顯著，不同大寫字母表示α= 0. 01 水平上差異極顯著。下同。

2.2 不同6-BA濃度對高羊茅愈傷組織誘導的影響

經(jīng)過消毒處理的高羊茅種子在配有不同濃度6-BA的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)7 d后，開始發(fā)芽。由表2可以看出，不同濃度的6-BA對高羊茅的發(fā)芽率影響不明顯，并且高羊茅的發(fā)芽率對其愈傷組織誘導的影響差異也未達顯著水平。最終統(tǒng)計結(jié)果表明，高羊茅的發(fā)芽率與6-BA的濃度和出愈率均未達顯著水平的相關(guān)。

不同6-BA濃度培養(yǎng)基接種的高羊茅外植體暗培養(yǎng)7 d后，大部分高羊茅種子在芽鞘和種子連接處產(chǎn)生了白色水浸狀、柔軟松散的物質(zhì)；20 d后開始出現(xiàn)淡黃色的愈傷組織。40 d后統(tǒng)計不同處理的愈傷組織誘導結(jié)果，不同濃度的6-BA處理，其高羊茅愈傷組織的誘導率不同。在5種6-BA處理濃度中，濃度0.8 mg/L的出愈率為23.3%，極顯著高于其他處理濃度的出愈率；濃度為0.6 mg/L的出愈率極顯著高于濃度為0.2 mg/L和0.4 mg/L的出愈率(表2)。由此說明，當6-BA在一定范圍濃度內(nèi)，隨著6-BA濃度的增加，高羊茅愈傷組織的誘導率也隨之增加。

表2 不同6-BA濃度的高羊茅種子發(fā)芽率與出愈率

3.3 不同高羊茅品種對愈傷組織誘導的影響

從表3和表4可知，不同高羊茅品種在不同2，4-D濃度和不同6-BA培養(yǎng)基接種后的發(fā)芽率差異均未達顯著水平。以獵狗5號的發(fā)芽率最高，但其出愈率卻不是最高的，由此表明高羊茅品種的發(fā)芽率與其出愈率不存在顯著相關(guān)，但是，不同高羊茅品種對其愈傷組織的誘導率存在明顯基因型差異。由表3可知，不同高羊茅品種種子在2,4-D培養(yǎng)基中的愈傷組織的誘導率不同，交戰(zhàn)Ⅱ的出愈率為28.4%，極顯著高于其他2個高羊茅品種；而獵狗5號和貝克的出愈率差異未達顯著水平。

表3 不同高羊茅品種在2，4-D培養(yǎng)基中的平均發(fā)芽率與出愈率

從表4可以看出，不同高羊茅品種種子在6-BA培養(yǎng)基中的愈傷組織的誘導率不同，獵狗5號的愈傷組織出愈率為16%，極顯著高于其他2個高羊茅品種。同一高羊茅品種種子在不同激素作用下的出愈率不同。如貝克在不同濃度2,4-D和不同濃度6-BA培養(yǎng)基接種后的發(fā)芽率幾乎沒有變化，但其平均出愈率卻相差12.5個百分點。

表4 不同高羊茅品種在6-BA培養(yǎng)基中的平均發(fā)芽率與出愈率

3 討論

3.1 不同2,4-D和6-BA濃度對高羊茅愈傷組織誘導的影響

本研究采用獵狗、交戰(zhàn)Ⅱ和貝克等3個高羊茅品種的成熟種子為外植體，進行了不同濃度2,4-D和不同濃度6-BA培養(yǎng)基的高羊茅愈傷組織誘導研究。結(jié)果表明，植物生長素2,4-D對該3個高羊茅品種愈傷組織的誘導有明顯的促進作用。當2，4-D濃度在0～9 mg/L范圍內(nèi)，隨著2,4-D濃度的增加，其愈傷組織的誘導率升高；但當2,4-D濃度增高到一定程度(9 mg/L)后，其誘導率呈下降趨勢。郎春秀等[3]研究發(fā)現(xiàn)，2,4-D對高羊茅愈傷組織誘導的最佳濃度為8 mg/L，而高麗美等[11]試驗結(jié)果顯示，2,4-D誘導高羊茅成熟種子的最佳濃度是9 mg/L，這與本試驗研究的結(jié)果基本吻合。

本研究表明，當6-BA濃度在0～0.8 mg/L范圍內(nèi)，隨著6-BA濃度的增加，高羊茅愈傷組織的誘導率也隨之有升高的趨勢；當6-BA濃度增加到0.8 mg/L時，雖然高羊茅的愈傷組織誘導率升高，但其長勢卻變差，愈傷組織不透明、硬實，生長緩慢，最后轉(zhuǎn)變?yōu)榘迭S色，利用價值低。本研究只研究了一定濃度6-BA對不同高羊茅品種愈傷組織誘導率的影響，今后還可以在此基礎(chǔ)上繼續(xù)研究不同濃度6-BA對高羊茅愈傷組織分化的影響，進而獲得最佳的促進高羊茅愈傷組織誘導的6-BA濃度。

本研究采用了3個不同高羊茅品種的成熟種子為外植體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在MS培養(yǎng)基上添加6～9 mg/L 2,4-D和0.4～0.6 mg/L 6-BA對高羊茅愈傷組織的誘導都有較大的促進作用。而此前劉衛(wèi)東等的研究認為，不同種類的基本培養(yǎng)基對愈傷組織誘導沒有顯著差異。易自力等[13]通過比較NB、MS和CC 3種植物組織培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基，認為進行高羊茅成熟種子愈傷組織誘導宜采用CC培養(yǎng)基。何陽鵬等[14]通過試驗發(fā)現(xiàn)BA對愈傷組織的誘導存在一定濃度的負效應，在培養(yǎng)基中添加的BA濃度越高，愈傷誘導率越受抑制。為了進一步提高高羊茅種子愈傷組織的誘導率，今后可選用多種植物生長素和植物細胞分裂素濃度配比及其添加其他生物活性物質(zhì)進行試驗，從而獲得最佳植物激素組合的培養(yǎng)基。

3.2 不同基因型對高羊茅愈傷組織誘導的影響

本研究采用了湖南等我國草坪過渡帶地區(qū)常用的3個高羊茅品種進行不同濃度的2,4-D和不同濃度6-BA培養(yǎng)基的愈傷組織誘導研究，結(jié)果表明，3個供試高羊茅品種成熟種子愈傷組織誘導率存在一定的基因型差異。如在不同2,4-D濃度培養(yǎng)基誘導高羊茅愈傷組織的試驗中，3個高羊茅品種的發(fā)芽率相似，但平均出愈率卻相差甚大，其中，交戰(zhàn)Ⅱ的平均出愈率為28.4%，極顯著高于其他2個高羊茅品種的出愈率。高羊茅組織培養(yǎng)的基因型差異在以往已有相關(guān)報道。如：Bai和Qu[15]的研究表明，在25個供試品種中，愈傷組織誘導率相差達數(shù)倍甚至10倍以上。郎春秀等[3]在研究中發(fā)現(xiàn)，當2,4-D濃度為8 mg/L、ABA濃度為2 mg/L時，高羊茅可奇思的愈傷組織誘導率高出獵狗5號13.4個百分點。吳關(guān)庭等[16]通過試驗發(fā)現(xiàn)，在BAP與KT配比、NAA濃度和瓊脂濃度試驗中，各自適宜濃度條件下，高羊茅獵狗5號的總愈傷組織再生率比美洲虎3號高23.8～29.3個百分點。余桂紅等[5]以5個高羊茅品種成熟種子為外植體，研究表明，不同高羊茅品種成熟種子在相同培養(yǎng)基上的出芽率和出愈率差異很大。這些結(jié)果表明，在今后有關(guān)高羊茅愈傷組織培養(yǎng)的研究中，應針對不同高羊茅品種選擇相適宜的激素濃度，以達到最佳誘導效果。并且在此基礎(chǔ)上，進一步研究不同激素種類及濃度對高羊茅愈傷組織誘導的影響，最終實現(xiàn)湖南本地高羊茅草種的抗熱性改良，實現(xiàn)高羊茅在湖南等草坪草過渡性地帶的四季常綠。

[1] 陳寶書.牧草飼料作物栽培學[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.329-330.

[2] 葛榮朝，趙寶存，秘彩莉.高羊茅的組織培養(yǎng)和愈傷組織誘變[J].河北師范大學學報(自然科學版)，2007,20(4):5-11.

[3] 郎春秀，吳關(guān)庭，胡張華.高羊茅成熟種子組織培養(yǎng)的影響因素研究 I.多種因素對愈傷組織誘導的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2005,11(4):55-59.

[4] 胡繁榮，夏英武.輻照對高羊茅愈傷組織誘導及農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化的影響[J].上海交通大學學報(農(nóng)業(yè)科學版)，2005,31(2):12-17.

[5] 余桂紅，馬鴻翔，佘建明.草坪型高羊茅成熟種子胚性愈傷組織誘導及植株再生[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報，2004,5(1):14-20.

[6] 江巨鰲，趙運林，陳智勇.高羊茅愈傷組織再生系統(tǒng)的建立[J].湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版)，2003,18(5):45-49.

[7] 楊 揚，何勝江，吳 凱，等.高羊茅再生體系及其遺傳轉(zhuǎn)化研究進展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009，(1):42-44.

[8] 韓春梅，張新全，彭 燕，等.高羊茅草坪的坪用價值比較[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2007，35(5):1339-1341.

[9] 何 勇，田志宏，鄭川璉.高羊茅成熟胚離體培養(yǎng)及高頻植株再生[J].草業(yè)科學，2005，22(6):23-28.

[10]李志亮，葉 嘉，楊 杰，等.高羊茅組培再生體系建立的研究[J].邯鄲學院學報，2006，16(3):60-63.

[11]高麗美，徐子勤，張永彥，等.高羊茅組織培養(yǎng)再生體系及GUS基因瞬間表達研究[J]. 西北植物學報，2004,25(1):40-45.

[12]王 健，徐子勤，張永彥，等.高羊茅高頻再生體系的建立[J].西北大學學報(自然科學版)，2007，37(2):257-260.

[13]易自力，陳志勇，蔣建雄，等.三種冷季型草坪草愈傷組織再生體系的建立[J].中南林學院學報，2005,25(1):25-28.

[14]何陽鵬，于海濤.不同種胚及激素處理對高羊茅愈傷組織誘導的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2003，31(3):371-374.

[15]Bai Y，Qu R.An evaluation of callus induction and plant regeneration in twenty-five turf-type tall fescue (FestucaarundinaceaSchreb.) cultivars[J]. Grass and Farage Sci，2000,55(4):326-330.

[16]吳關(guān)庭，胡張華，陳笑蕓，等.高羊茅成熟種子組織培養(yǎng)的影響因素研究 Ⅱ.多種因素對胚性愈傷組織分化的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2006,18(6):412-416.

S543+.901

A

1001-5280(2012)07-0021-04

10.3969/j.issn.1001-5280.2012.07.06