粒細胞集落刺激因子聯(lián)合缺血后適應治療急性心肌梗死的實驗研究*

于宗良, 陳 樂, 楊向軍

(1江蘇大學附屬昆山醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 昆山 215300； 2蘇州大學附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 蘇州 215006)

1000-4718(2012)11-1933-05

2012-04-17

2012-10-15

昆山市科技局計劃項目(No.KS1002)

△通訊作者 Tel: 0512-57592630; E-mail: zl-yu@sohu.com

粒細胞集落刺激因子聯(lián)合缺血后適應治療急性心肌梗死的實驗研究*

于宗良1△, 陳 樂2, 楊向軍2

(1江蘇大學附屬昆山醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 昆山 215300；2蘇州大學附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 蘇州 215006)

目的探討粒細胞集落刺激因子(G-CSF)聯(lián)合缺血后適應(IP)對實驗兔急性心肌梗死的心臟保護作用。方法將兔結(jié)扎左室支(LVA)后分為4組：缺血再灌注模型組(IR組,松結(jié)后直接再灌注)、G-CSF組(松結(jié)并于術后12 h開始使用G-CSF皮下注射)、IP組(予以IP行改良再灌注)和G-CSF + IP組(聯(lián)合應用IP及G-CSF干預)。觀察各組術中心電圖ST段變化，檢測手術前后血常規(guī)和心肌鈣蛋白I(cTnI)，術后4周行超聲心動圖檢查，測定各組梗死心肌的面積、組織病理結(jié)構和細胞凋亡。結(jié)果IP組術中ST段回落快于模型組；G-CSF處理后，實驗動物血常規(guī)中白細胞明顯增高；IP組、G-CSF組及聯(lián)合治療組術后7 d的cTnI明顯低于模型組; 術后4周超聲心動圖結(jié)果顯示，IP組、G-CSF組及聯(lián)合治療組指標好于模型組，聯(lián)合治療組最佳; IP組、G-CSF組及聯(lián)合治療組梗死心肌面積均明顯低于模型組，梗死周邊細胞凋亡程度低、血管密度高，聯(lián)合治療組最好。結(jié)論G-CSF聯(lián)合IP可有效減輕心肌梗死后急性期的再灌注損傷，有利于恢復期的心臟修復。

粒細胞集落刺激因子； 缺血后適應； 心肌梗死； 再灌注損傷

粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)可以動員骨髓干細胞修復心肌梗死后受損的心臟[1-4]，缺血后適應(ischemic postconditioning, IP)可以減輕急性心肌缺血再灌注損傷[5-7]，二者對急性心肌梗死的治療價值受到較多的關注，然而目前它們各自的治療效果尚不滿意[4，7]。本實驗探討G-CSF和IP聯(lián)合應用對實驗兔急性心肌梗死的心臟保護作用。

材 料 和 方 法

1動物模型構建

雄性新西蘭大白兔，體重2.2～2.8 kg，麻醉后開胸，取左心耳下緣與心尖連線中點為結(jié)扎平面，雙線雙結(jié)法結(jié)扎左室支(left ventricular artery,LVA)[8]。結(jié)扎局部心肌活動明顯減弱、顏色變白，監(jiān)護心電圖出現(xiàn)缺血性ST-T改變及血清心肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)升高為制模成功的標志。

2藥物及劑量

G-CSF注射液(商品名：潔欣),采用10 μg·kg-1·d-1，皮下注射連續(xù)5 d。

3動物分組及處理

結(jié)扎LVA 30 min后將實驗動物隨機分為4組。缺血再灌注模型組(IR組): 松開結(jié)扎的線結(jié)進行再灌注，12 h后開始皮下注射生理鹽水0.5 mL，連續(xù)5 d；G-CSF組:松結(jié)后行再灌注，于術后12 h皮下注射G-CSF,連續(xù)5 d；IP組:先通過松解和收緊LVA的線結(jié)，行缺血30 s/再灌注30 s的連續(xù)循環(huán)4次后適應處理，再完全恢復LVA血流，術后12 h連續(xù)5 d皮下注射生理鹽水；G-CSF + IP組:即同時采用IP及G-CSF 2種方法處理。各組完成再灌注15 min后，關閉胸腔，精心飼養(yǎng)。在手術操作時及術后飼養(yǎng)過程中，動物有死亡后隨即增補，直至每組滿15只。

4血常規(guī)和cTnI檢測

麻醉后抽取股靜脈血2 mL，分別留作血常規(guī)(Beckman Counter Counter LH 750 Analyzer，抗凝后1 mL)及cTnI(購自ADL，血樣于2 500 r/min離心15 min，取上清液，置于EP管存放于-80 ℃冰箱內(nèi)保存，集中備檢)檢測。7 d后再次抽血復測。

5超聲心動圖檢查

兔飼養(yǎng)至術后4周，使用心超儀(飛利浦Sonos 7500 型，二維切面及M超)測量左房內(nèi)徑、室間隔厚度、左室后壁厚度、左室舒張期末徑(left ventricular internal diameter at end-diastole, LVIDd)、左室收縮期末徑(left ventricular internal diameter at end-systole, LVIDs)和左室短軸縮短率，估算左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)。

6組織病理學檢查

動物完成超聲檢查后處死，取其心臟于-80 ℃冷凍0.5 h,沿左室長軸將左室橫切為厚約2mm的薄片，稱重后行氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色，以區(qū)分開灰白色的梗死心肌與磚紅色的存活心肌，濾紙吸干后分別稱重。心肌梗死面積(%)=梗死心肌重量/左室心肌重量×100%。心肌標本用生理鹽水沖凈，甲醛固定，石蠟包埋切片后行蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色。觀察梗死灶及周邊心肌細胞的壞死、炎癥細胞浸潤、瘢痕形成和血管新生情況等。微血管密度(microvessel density, MVD)測定采用Weidner等[9]雙盲法。

7細胞凋亡檢測

以原位末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記[terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT) - mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL]法檢測，觀察各組實驗動物梗死周邊區(qū)域心肌細胞的凋亡情況。

8統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1術中心電監(jiān)護

實驗動物結(jié)扎左室支缺血數(shù)分鐘內(nèi)，心電監(jiān)護Ⅱ?qū)?lián)示ST段較結(jié)扎前明顯抬高；松結(jié)再灌注15 min后，與常規(guī)再灌注組(IR、G-CSF)相比，采用后適應改良再灌注的2組(IP及IP+G-CSF)，ST段回落明顯加快，差異顯著(P<0.05)，見圖1、表1。

Figure 1. ST-segment resolutions after reperfusion

圖1采用后適應再灌注組與對照組ST段回落的比較

表1各組再灌注后II導聯(lián)ST段回落的比較

GroupOcclusionReperfusionIR3．70±0．551．80±0．81G-CSF3．47±0．491．74±0．78IP3．74±0．620．84±0．52?G-CSF+IP3．58±0．590．79±0．49?

*P<0.05vsIR.

2血液學檢測

2.1血常規(guī)白細胞計數(shù) 使用G-CSF注射1周后的2組白細胞較術前明顯升高(P<0.05)，而生理鹽水組的變化則不大，見表2。

表2G-CSF使用前后白細胞計數(shù)的變化

GroupBeforeoperation7dafteroperationIR9．5±2．15．4±3．8G-CSF6．4±2．213．8±12．9?IP8．2±3．88．5±5．6G-CSF+IP6．1±2．412．3±6．7?

*P<0.05vsbefore operation.

2.2血清cTnI濃度測定 術后7 d各組cTnI均較術前升高，G-CSF組、IP組和G-CSF+ IP組明顯低于IR模型組 (P<0.05)，聯(lián)合組最低，見表3。

表3各組手術前后血清cTnI的變化

GroupBeforeoperation7dafteroperationIR0．27±0．143．34±2．21?G-CSF0．31±0．111．69±1．65?△IP0．26±0．091．62±1．70?△G-CSF+IP0．29±0．121．54±1．02?△

*P<0.05vsbefore operation;△P<0.05vsIR.

3超聲心動圖檢測

術后4周心超檢查示,IR組LVIDd最大，LVIDs也最大，LVEF最差；聯(lián)合治療組的心室重構最輕，LVIDd和LVIDs均最小，LVEF明顯優(yōu)于其它3組(P<0.05)，見圖2、表4。

Figure 2. Ultrasound cardiography changes in each group.A: IR group；B： G-CSF group； C： IP group； D： G-CSF+IP group.

圖2術后4周超聲心動圖

表4術后4周各組超聲心動檢查的比較

GroupLVIDd(mm)LVIDs(mm)LVEF(%)IR18．5±4．313．1±2．758．2±7．5 G-CSF16．5±2．811．1±4．762．20±9．3?△IP16．2±4．311．8±3．361．3±8．7?△G-CSF+IP15．9±4．410．5±4．570．9±9．8??

*P<0.05,**P<0.01vsIR;△P<0.05vsG-CSF+IP.

4組織病理學分析

4.1心肌梗死面積測定 TTC染色后可見蒼白色的梗死區(qū)與磚紅色的存活區(qū)分界明顯。與IR模型組相比，G-CSF組、IP組和G-CSF+IP組心肌梗死面積均明顯減少，G-CSF+IP組梗死范圍最小，但與G-CSF組及IP組相比無顯著差異，見圖3、表5。

4.2顯微鏡觀察 IR組梗死區(qū)域淋巴細胞浸潤較多，被大量的纖維瘢痕組織替代，結(jié)構最紊亂，梗死周邊區(qū)域小血管增生不明顯。余3組中，淋巴細胞浸潤、纖維瘢痕組織數(shù)量和范圍明顯縮小，梗死區(qū)域可見存活心肌細胞，以聯(lián)合治療組最好。使用G-CSF的2組小血管數(shù)目明顯增多，見圖4、表6。

Figure 3. Myocardium aftter TTC staining in each group.Pale:necrosis myocardium; brick red: survived myocardium.

圖34組心肌標本的TTC染色

表5各組左室重量、梗死心肌重量、心肌梗死范圍的比較

GroupWeightofLV(g)WeightofMI(g)Infarctsize(%)IR3．31±0．681．04±0．4531．37±12．18G-CSF3．24±0．620．64±0．37?19．56±7．39?IP3．10±0．980．57±0．29?18．27±4．76?G-CSF+IP3．11±0．850．52±0．24?16．42±6．03?

LV:left ventricule; MI:myocardial infarction.*P<0.05vsIR.

Figure 4. Myocardium aftter HE staining in each group(×400).A: IR group; B: G-CSF group; C: IP group; D: G-CSF+IP group.

圖4各組心肌HE染色切片

表6各組梗死灶周邊微血管密度的比較

GroupMVDIR1．12±2．21G-CSF3．82±1．75?IP2．10±1．49G-CSF+IP4．10±2．01??△

*P<0.05,**P<0.01vsIR;△P<0.05vsIP.

5細胞凋亡檢測

采用TUNEL法檢測，IR組、G-CSF組、IP組和G-CSF+IP梗死灶周邊區(qū)均出現(xiàn)TUNEL陽性細胞(凋亡細胞核被染成棕黃色)，干預組凋亡指數(shù)與IR模型組有顯著差異(P<0.05)，3個干預組間差異不顯著，見圖5、表7。

Figure 5. Cardiac myocyte apoptosis in each group under fluorescence microscope (brown dot: apoptotic nuclear staining，×40).A: IR group; B: G-CSF group; C: IP group; D: G-CSF+IP group.

圖5熒光顯微鏡下各組凋亡情況的比較

表7各組梗死灶周邊心肌細胞凋亡指數(shù)的比較

GroupApoptoticindexIR32±4G-CSF16±2?IP17±2?G-CSF+IP15±1?

*P<0.05vsIR.

討 論

本實驗聯(lián)合G-CSF和IP 2種手段干預急性心肌梗死，結(jié)果表明，與單純?nèi)毖俟嘧⒛Ｐ徒M相比，IP或G-CSF均能顯著減輕心肌損傷、縮小梗死心肌面積，同時IP或G-CSF組的心室重構、結(jié)構損傷及細胞凋亡程度較對照組明顯減輕，使用G-CSF組的梗死周邊區(qū)域新生微血管明顯增多，而其中IP與G-CSF聯(lián)合應用組的心肌保護作用較單用IP或G-CSF更好。

減輕心肌急性期缺血再灌注損傷，減少心肌細胞凋亡，保證有活力的心肌細胞數(shù)量，減輕恢復期的心室重構，是改善急性心肌梗死預后的關鍵[5]。G-CSF主要是通過動員骨髓干細胞，促進心肌再生和血管生成而發(fā)揮心臟保護作用[4]，為急性心肌梗死的內(nèi)科藥物治療開辟了一條新途徑。IP即心肌缺血后，在再灌注之前，進行一次或數(shù)次短暫重復的心肌缺血/再灌注，可提高心肌對之前發(fā)生的缺血的耐受性，以減少缺血/再灌注損傷[7,10]，由于急診冠狀動脈介入手術的發(fā)展、普及等，通過術中冠狀動脈內(nèi)球囊的充氣與放氣即可簡便地完成后適應操作，有較好的臨床可操作性，從而成為研究的熱點。

部分動物實驗及臨床試驗證實G-CSF和IP的具有一定的心肌保護作用，但是它們各自治療急性心肌梗死的應用結(jié)果，目前尚不盡人意，確切的機制和療效仍有較多爭議[4,7]。聯(lián)合多種治療方法，從多種機制著手，多靶點發(fā)揮心肌保護作用來治療急性心肌梗死，應該是一個值得探索的方向。

IP可以減少急性缺血再灌注損傷，而且可能減少循環(huán)中不利于干細胞歸巢到梗死心肌部位的體液因素。G-CSF動員骨髓干細胞直接分化為心肌細胞及血管組織修復受損的心肌，另一方面可能直接作用于靶細胞上的受體發(fā)揮細胞保護作用等[11]，協(xié)同達到減少再灌注損傷、減輕細胞凋亡程度，促進梗死周邊的心肌、血管生成等，從而利于心臟修復、防治心室重構，有效保護了急性心肌梗死后的心功能。

我們的初步實驗結(jié)果表明，G-CSF聯(lián)合IP治療急性心肌梗死有效可行，值得更深入的研究。

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Cardiacprotectiveeffectofgranulocytecolony-stimulatingfactorcombinedwithischemicpostconditioningonacutemyocardialinfarctioninrabbits

YU Zong-liang1, CHEN Le2, YANG Xiang-jun2

(1DepartmentofCardiology,KunshanHospitalAffiliatedtoJangsuUniversity,Kunshan215300,China;2DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215006,China.E-mail:zl-yu@sohu.com)

AIM: To investigate the protective effect of granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) combined with ischemic postconditioning (IP) on acute myocardial infarction (AMI).METHODSMale New Zealand rabbits were randomly divided into 4 groups (n=15) after 30 min of left ventricular artery (LVA) occlusion: the rabbits in ischemia-reperfusion (IR) group were directly given reperfusion; the rabbits in G-CSF group were subsequently treated with G-CSF (10 μg·kg-1·d-1) by subcutaneous injection after direct reperfusion; the rabbits in IP group

4 episodes of 30 s reperfusion and 30 s occlusion before total reperfusion; the rabbits in IP combined with G-CSF (IP+G-CSF) group were treated with both IP and G-CSF. Electrocardiogram (ECG) monitoring was performed during the operation. Blood was drawn to evaluate white blood cell count (WBC) and cardiac troponin I (cTnI) before operation and 7 d later. Ultrasound cardiography was performed to evaluate left ventricular remodeling and functions 4 weeks after operation. The sizes of infarcted myocardium were determined by triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining. Apoptosis of cardiomyocytes was measured by terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) staining.RESULTSST-segment resolutions were significantly decreased in IP group and IP+G-CSF group compared with direct reperfusion groups (P<0.05). WBC significantly increased in the groups treated with G-CSF for 1 week. The values of cTnI after operation were significantly lowered in G-CSF group, IP group and IP+G-CSF group as compared with IR group (P<0.05). Left ventricular ejection fraction, the size of infarcted myocardium and apoptosis of cardiomyocytes were better in IP group, G-CSF group and IP+G-CSF group than those in IR group.CONCLUSIONG-CSF combined with IP is a promising strategy against cardiac reperfusion injury and accelerates cardiac repair in AMI.

Granulocyte colony-stimulating factor; Ischemic postconditioning; Myocardial infarction; Reperfusion injury

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.11.003