樊芳芳， 胡曉蕓， 扈麗娟， 韓葆芬， 趙瑛娟

(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，山西 太原 030001)

1000-4718(2012)04-0727-03

2011-10-17

2011-12-31

山西省衛(wèi)生廳科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(No.20100201)

△通訊作者 Tel：0351-4639901；E-mail：huxiaoyunly@sina.com

辛伐他汀對(duì)香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)sEPCR和mEPCR的影響*

樊芳芳， 胡曉蕓△， 扈麗娟， 韓葆芬， 趙瑛娟

(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，山西 太原 030001)

目的研究辛伐他汀對(duì)香煙煙霧提取物(CSE)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs) 表達(dá)可溶性內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(sEPCR)和膜聯(lián)內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(mEPCR)的干預(yù)作用。方法體外培養(yǎng)的4～6代HUVECs 隨機(jī)分為對(duì)照組、5%CSE組、不同濃度辛伐他汀組及辛伐他汀干預(yù)組，辛伐他汀組分別加入50、100、200 μmol/L辛伐他汀液孵育24 h，辛伐他汀干預(yù)組先以50、100、200 μmol/L辛伐他汀預(yù)處理細(xì)胞2 h，再與5%CSE孵育24 h。收集各組細(xì)胞及上清液，ELISA法檢測(cè)上清液中sEPCR蛋白含量，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中mEPCR mRNA的表達(dá)。結(jié)果(1)5%CSE組sEPCR蛋白含量高于對(duì)照組，mEPCR mRNA表達(dá)低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；(2)100 μmol/L與200 μmol/L辛伐他汀組sEPCR蛋白含量均高于對(duì)照組，低于5%CSE組，其mEPCR mRNA表達(dá)均低于對(duì)照組，高于5%CSE組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；(3)各辛伐他汀干預(yù)組sEPCR蛋白含量均低于5%CSE組，但高于對(duì)照組及相應(yīng)濃度的辛伐他汀組；相反，各辛伐他汀干預(yù)組mEPCR mRNA表達(dá)均高于5%CSE組，低于對(duì)照組及相應(yīng)濃度的辛伐他汀組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。結(jié)論在體外，辛伐他汀通過(guò)上調(diào)HUVECs mEPCR mRNA的表達(dá)，降低sEPCR的分泌，對(duì)CSE介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凝血功能障礙可能具有一定的改善作用。

香煙煙霧提取物； 內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體； 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

近年來(lái)，內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(endothelial cell protein C receptor，EPCR)與血栓形成的關(guān)系引起學(xué)術(shù)界的高度重視。當(dāng)各種因素導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)，膜聯(lián)EPCR(membrane-associated EPCR，mEPCR)從內(nèi)皮細(xì)胞脫落，致使可溶性EPCR(soluble EPCR，sEPCR)濃度升高，使血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。 因此，測(cè)定sEPCR成為反映血栓形成的敏感指標(biāo)之一[1]。辛伐他汀除其調(diào)脂作用之外，還具有內(nèi)皮保護(hù)、抗凝、抑制血小板聚集與抗炎等作用[2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察不同濃度辛伐他汀對(duì)香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract，CSE)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)sEPCR蛋白及mEPCR mRNA表達(dá)的影響，探討其對(duì)CSE介導(dǎo)的HUVECs凝血功能的干預(yù)作用。

材 料 和 方 法

1材料

HUVECs株購(gòu)自上海門(mén)諜塔生物科技發(fā)展有限公司，為ATCC來(lái)源細(xì)胞株。RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、HEPES均購(gòu)自Gibco，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自杭州四季青公司，青霉素、鏈霉素均購(gòu)自華北制藥股份有限公司，辛伐他汀為默沙東公司產(chǎn)品。人sEPCR ELISA試劑盒購(gòu)自上海西唐公司，PCR引物、Trizol RNA提取試劑盒、內(nèi)參照β-actin引物均由上海生工生物工程公司合成，SYBR Green 購(gòu)自Roche。

2方法

2.1CSE的制備 參照Nakamura等[3]方法，將2支過(guò)濾嘴香煙用一個(gè)注射器驅(qū)動(dòng)裝置連續(xù)抽吸而燃著，每支煙吸5 min，以-5 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)的負(fù)壓持續(xù)吸引，產(chǎn)生的煙霧經(jīng)三通管的另一負(fù)壓驅(qū)動(dòng)出口溶于50 mL無(wú)血清培養(yǎng)液中制成懸液，用1 mol/L的NaOH調(diào)pH至7.4，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，于30 min之內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。

2.2辛伐他汀干預(yù)藥物的制備 將脂溶性辛伐他汀片4.3259 mg(40 mg/片，默沙東中國(guó)有限公司，相對(duì)分子質(zhì)量432.59)溶于100 μL無(wú)水乙醇，加入150 μL NaOH(1 mol/L)50 ℃溫育2 h，用0.1mol/L HCl調(diào)pH至7.2，加雙蒸水至10 mL，即制得終濃度為1 mmol/L的儲(chǔ)存液。經(jīng)0.22 μm微孔濾器過(guò)濾，4 ℃保存，備用。

2.3HUVECs的培養(yǎng)與分組 用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞，隔日換液1次，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化液以1∶2傳代，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞達(dá)80%融合后，換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h，使細(xì)胞同步化。貼壁細(xì)胞隨機(jī)分為8組：(1)CSE組：培養(yǎng)瓶中加入150 μL的CSE，加RPMI-1640培養(yǎng)液至3 mL，使其終濃度為5%CSE；(2)對(duì)照組(陰性對(duì)照)：培養(yǎng)液中加入與CSE組相同體積的無(wú)菌PBS液；(3)辛伐他汀組(陽(yáng)性對(duì)照)：培養(yǎng)液中分別加入50、100、200 μmol/L 辛伐他汀液；(4)辛伐他汀干預(yù)組：先分別于培養(yǎng)液中加入50、 100、 200 μmol/L辛伐他汀預(yù)孵育2 h，再加入5% CSE孵育。以上各組共同培養(yǎng)24 h，分別收集細(xì)胞及上清液用于實(shí)驗(yàn)。

2.4酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心分析法(enzyme linked-immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)sEPCR的含量 實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明步驟進(jìn)行。sEPCR標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為4 000、2 000、1 000、500、250、125、62.5 ng/L。

2.5Real-time RT-PCR檢測(cè)mEPCR mRNA的表達(dá) 按Trizol試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA。取6 μL的總RNA按轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的cDNA，PCR擴(kuò)增mEPCR和β-actin(作為內(nèi)參照)。mEPCR上游引物5’-GGTGTGGCTGTAGGCATCTT-3’，下游引物5’-CTCCCCTCCCTCAAATCTTC-3’。β-actin上游引物5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’，下游引物5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’。反應(yīng)體系為10×buffer 5 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，正反向引物各0.5 μL，Taq 酶 0.5 μL，SYBR Green 25 μL，DEPC-H2O 19.0 μL混勻。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性180 s，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共反應(yīng)35個(gè)循環(huán)。ABI Prism 7300SDS軟件記錄數(shù)據(jù)并分析，將目的基因的Ct用β-actin的Ct值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，根據(jù)比較法計(jì)算基因表達(dá)相對(duì)量，采用2-ΔΔCt計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)倍數(shù)變化。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1HUVECs形態(tài)觀察

倒置相差顯微鏡下HUVECs可見(jiàn)細(xì)胞由均勻懸浮狀態(tài)逐漸貼壁，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈扁平、橢圓形、梭形或多角形，為單層鵝卵石鑲嵌樣排列，細(xì)胞單層融合時(shí)呈典型的“鋪路石”樣外觀。

25%CSE對(duì)HUVECs表達(dá)sEPCR蛋白與mEPCRmRNA的影響

對(duì)照組HUVECs可表達(dá)一定量的mEPCR mRNA，上清液中存在少量sEPCR，5%CSE干預(yù)后其mEPCR mRNA表達(dá)明顯減少，sEPCR蛋白含量增多，各組比較見(jiàn)表1。

3辛伐他汀對(duì)HUVECs表達(dá)sEPCR蛋白與mEPCRmRNA的影響

一定濃度的辛伐他汀可影響HUVECs表達(dá)sEPCR蛋白與mEPCR mRNA，其與對(duì)照組及5%CSE組的比較結(jié)果見(jiàn)表1。兩兩比較提示， 50 μmol/L辛伐他汀組mEPCR mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；100、200 μmol/L辛伐他汀組mEPCR mRNA表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，200 μmol/L辛伐他汀組mEPCR mRNA表達(dá)高于100 μmol/L辛伐他汀組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。各辛伐他汀組mEPCR mRNA表達(dá)均高于5%CSE組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。sEPCR蛋白表達(dá)與mEPCR mRNA呈相反變化。

表1各組HUVECssEPCR蛋白和mEPCRmRNA含量的比較

GroupsEPCRprotein(ng/L)mEPCRmRNAControl1071.197±54.3031.185±0.0725%CSE2239.153±52.271*0.206±0.073*50μmol/Lsimvastatin1133.247±39.412△1.061±0.048*△100μmol/Lsimvastatin1243.353±52.308*△0.956±0.011*△200μmol/Lsimvastatin1355.143±48.820*△0.861±0.052*△5%CSE+50μmol/Lsimvastatin1825.540±116.535*△0.484±0.029*△5%CSE+100μmol/Lsimvastatin1377.197±51.083*△#0.718±0.037*△#5%CSE+200μmol/Lsimvastatin1553.810±46.911*△#0.843±0.026*△#

*P<0.05vscontrol；△P<0.05vs5%CSE；#P<0.05vs5%CSE+50 μmol/L simvastatin.

4辛伐他汀對(duì)CSE介導(dǎo)HUVECs表達(dá)sEPCR蛋白與mEPCRmRNA的干預(yù)作用

各濃度辛伐他汀干預(yù)組sEPCR蛋白含量均低于5%CSE組，但仍高于對(duì)照組及相對(duì)應(yīng)濃度的辛伐他汀組；相反，各濃度辛伐他汀干預(yù)組mEPCR mRNA表達(dá)均高于5%CSE組，但仍低于對(duì)照組及相對(duì)應(yīng)濃度的辛伐他汀組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。辛伐他汀對(duì)CSE介導(dǎo)HUVECs 表達(dá)mEPCR mRNA的干預(yù)作用在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性。而對(duì)其表達(dá)sEPCR蛋白的干預(yù)作用雖在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性，但以100 μmol/L辛伐他汀干預(yù)組作用最明顯，見(jiàn)表1。

討 論

蛋白C(protein C,PC)是在抗凝過(guò)程中發(fā)揮重要作用的一種維生素K依賴性絲氨酸蛋白酶原[4]。在凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物激活下，蛋白C轉(zhuǎn)化為活化蛋白C(activated protein C,APC)，與輔因子蛋白S結(jié)合，從而滅活凝血因子Va和VIIIa，發(fā)揮抗凝作用[5]。EPCR是最近被發(fā)現(xiàn)并獲得成功克隆表達(dá)的一個(gè)新的內(nèi)皮細(xì)胞受體，是體內(nèi)蛋白C系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的新成員[6]。EPCR有mEPCR和sEPCR兩種存在形式，mEPCR無(wú)直接抗凝活性，通過(guò)與蛋白C結(jié)合并將其呈遞給凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物，增加PC/APC的活性，從而提高PC的活化率[7]。sEPCR具有抑制PC/APC活性的作用[8]，通過(guò)抑制PC的活化，抑制APC對(duì)凝血因子Va和VIIIa的滅活作用[8]。sEPCR與mEPCR是一對(duì)在凝血過(guò)程中作用相反的物質(zhì)，血漿中sEPCR升高或mEPCR減少均可導(dǎo)致抗凝機(jī)制受抑。

我們?cè)鴮?duì)CSE介導(dǎo)HUVECs纖溶活性的變化及其作用機(jī)制進(jìn)行研究[9-10]，發(fā)現(xiàn)5%CSE具有纖溶抑制作用。CSE是否對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的凝血功能也有影響，目前報(bào)道不多。因EPCR表達(dá)具有組織特異性，在胎盤(pán)、肺、肝和心肌組織呈高表達(dá)[11]，故本實(shí)驗(yàn)選用HUVECs作為細(xì)胞模型，研究CSE對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞sEPCR與mEPCR表達(dá)的影響。結(jié)果表明，CSE干預(yù)HUVECs后， 其mEPCR mRNA表達(dá)降低， sEPCR蛋白分泌增高，提示CSE可引起內(nèi)皮細(xì)胞凝血功能障礙。與Menschikowski等[12]研究結(jié)果一致。

目前認(rèn)為，辛伐他汀除其調(diào)脂作用之外，還具有內(nèi)皮保護(hù)、抗凝、抑制血小板聚集與抗炎等作用。辛伐他汀是否可以改善CSE介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凝血功能障礙，尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，辛伐他汀干預(yù)組內(nèi)皮細(xì)胞mEPCR mRNA的表達(dá)較5%CSE組升高，而sEPCR的含量則降低，提示辛伐他汀可能從基因與蛋白水平影響CSE介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凝血功能。

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Effectsofsimvastatinoncigarettesmokeextract-inducedsEPCRandEPCRexpressioninhumanumbilicalveinendothelialcells

FAN Fang-fang, HU Xiao-yun, HU Li-juan, HAN Bao-fen, ZHAO Ying-juan

(DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospital,ShanxiMedicineUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:huxiaoyunly@sina.com)

AIM: To investigate the effects of simvastatin on cigarette smoke extract (CSE)-induced expression levels of soluble endothelial cell protein C receptor (sEPCR) and membrane-associated endothelial cell protein C receptor (mEPCR ) in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).METHODSCultured HUVECs at passage 4 to 6 were randomly divided into control group, 5% CSE group, simvastatin groups and simvastatin+CSE groups. In simvastatin groups, HUVECs were incubated with simvastatin at the concentrations of 50, 100 and 200 μmol/L for 24 h. In simvastatin+CSE groups, the cells were treated with simvastatin at the concentrations of 50, 100 and 200 μmol/L for 2 h, and then exposed to CSE for 24 h. The protein level of sEPCR in the culture supernatants was measured by ELISA. The cells were collected for determining the mRNA expression of mEPCR by real-time PCR.RESULTSCompared with control group, the protein level of sEPCR was significantly increased, and the mRNA expression of mEPCR was significantly decreased in 5% CSE group (bothP<0.05) . The protein levels of sEPCR were significantly increased, and the mRNA expression of mEPCR was significantly decreased in 100 μmol/L and 200 μmol/L simvastatin groups. However, the protein levels of sEPCR were lower, and the mRNA expression of mEPCR was significantly higher in 100 μmol/L and 200 μmol/L simvastatin groups than those in 5% CSE group. Compared with 5% CSE group, the protein levels of sEPCR in simvastatin+CSE groups were significantly decreased, but higher than those in control group and simvastatin group with corresponding concentration. On the contrary, the mRNA expression of mEPCR in simvastatin+CSE groups was significantly increased, but lower than that in control group and simvastatin group with corresponding concentration (allP<0.05).CONCLUSIONSimvastatin obviously increases the mRNA expression of mEPCR, decreases the protein level of sEPCR, and attenuates the CSE-induced endothelial injuryinvitro.

Cigarette smoke extract; Endothelial cell protein C receptor; Human umbilical vein endothelial cells

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.026