劉曉丹， 徐 令， 檀衛(wèi)平， 顏慕霞

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1醫(yī)學(xué)研究中心，3兒科, 廣東 廣州 510120；2廣州市婦女兒童醫(yī)療中心血液科，廣東 廣州 510623)

1000-4718(2012)04-0738-04

2011-11-01

2011-12-27

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.S2011010004731)

△通訊作者 Tel:020-38076603; E-mail: luoxul64@yahoo.com

miR-125b在兒童AML中的表達(dá)及其反義寡核苷酸對(duì)白血病細(xì)胞的作用*

劉曉丹1， 徐 令2△， 檀衛(wèi)平3， 顏慕霞2

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1醫(yī)學(xué)研究中心，3兒科, 廣東 廣州 510120；2廣州市婦女兒童醫(yī)療中心血液科，廣東 廣州 510623)

目的研究?jī)和毙运杓?xì)胞白血病(AML)患者骨髓細(xì)胞中miR-125b的表達(dá)及miR-125b為靶標(biāo)的反義寡核苷酸對(duì)人白血病細(xì)胞的作用。方法采用基因芯片和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)檢測(cè)兒童AML治療前后骨髓細(xì)胞中miR-125b的表達(dá)。采用電轉(zhuǎn)法將與miR-125b序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h、96 h細(xì)胞增殖情況。結(jié)果芯片結(jié)果顯示miR-125b在兒童AML中表達(dá)明顯增高，約為正常的12倍，qRT-PCR結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了miR-125b在兒童AML中異常高表達(dá)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)miR-125b在兒童AML部分緩解的患者骨髓細(xì)胞中表達(dá)下降，在完全緩解患者骨髓細(xì)胞中降至正常水平。CCK-8結(jié)果顯示，針對(duì)miR-125b的反義寡核苷酸能有效抑制白血病細(xì)胞的增殖，與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.01)。結(jié)論miR-125b在兒童AML中可能起“癌基因”作用，以miR-125b為靶標(biāo)的反義寡核苷酸可能為兒童AML治療提供新的方法。

miR-125b； 寡核苷酸類(lèi)，反義； HL-60細(xì)胞

白血病是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的惡性腫瘤，15歲以下兒童白血病的發(fā)病率為4/10萬(wàn)左右，約占該時(shí)期惡性腫瘤的35%。隨著聯(lián)合化療和造血干細(xì)胞移植技術(shù)的應(yīng)用，兒童白血病的存活率大為改觀，但急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)的預(yù)后仍很差，5年存活率僅40%～50%[1]。因此，進(jìn)一步闡明AML發(fā)病的分子機(jī)制，尋找新的治療方法具有重要的意義。

長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)AML分子機(jī)制的研究主要著眼于染色體異常以及蛋白編碼基因，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)非編碼的microRNA(miRNA)與癌癥的發(fā)生、發(fā)展、臨床表現(xiàn)和預(yù)后都有密切的關(guān)系，在其中起著“促癌”或“抑癌”作用[2-6]。miRNA是一類(lèi)廣泛存在于動(dòng)物和植物等多細(xì)胞生物中約22個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，它通過(guò)與靶基因mRNA的3'-UTR區(qū)域部分或完全配對(duì)，引起mRNA切斷或轉(zhuǎn)錄抑制，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默，從而在生物許多功能基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著非常重要的作用[7]。如何發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)的miRNA，闡明其作用及調(diào)控機(jī)制，將它們整合到基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中是分子醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和前沿。

miRNA與白血病發(fā)生發(fā)展及預(yù)后也密切相關(guān)，近年來(lái)在各國(guó)科學(xué)家的努力下，白血病相關(guān)miRNA的研究取得了很大的進(jìn)展，各型白血病miRNA的表達(dá)譜被相繼報(bào)道，部分白血病相關(guān)的miRNA功能及其調(diào)控機(jī)制也被闡明。如Cimmino等[8]證實(shí) miR-15a/16-1可以通過(guò)下調(diào)靶基因 B 細(xì)胞淋巴瘤2(BCL2)的表達(dá)來(lái)誘發(fā)白血病細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮其抑癌基因的功能；Venturini等[9]報(bào)道慢性髓細(xì)胞白血病中很可能存在著B(niǎo)CR-ABL-c-Myc-miR-17-92通路的病理生理學(xué)機(jī)制。盡管在白血病相關(guān)的miRNA功能及其調(diào)控機(jī)制方面取得了重要進(jìn)展，但仍有很多功能、機(jī)制沒(méi)有完全闡明，特別是對(duì)兒童白血病的研究還少見(jiàn)報(bào)道。而兒童白血病的生物特性在臨床、病理組織及生物學(xué)方面與成人不同[1]，因此有必要特別針對(duì)兒童白血病，特別是AML相關(guān)的 miRNA的作用及其機(jī)制進(jìn)行研究，其作用和機(jī)制的闡明可能為兒童白血病治療提供新的靶點(diǎn)。

本文利用miRNA芯片技術(shù)對(duì)兒童AML的表達(dá)譜進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示miR-125b在AML中的表達(dá)增高，提示它可能與兒童AML相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，本文采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)對(duì)患兒治療前后的miR-125b表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，體內(nèi)研究miR-125b是否與兒童AML 相關(guān)，同時(shí)設(shè)計(jì)針對(duì)miR-125b的反義寡核苷酸，作用于白血病細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，研究miR-125b反義寡核苷酸對(duì)白血病細(xì)胞的作用，目的在于研究miR-125b的功能，其功能的闡明有利于揭示白血病中的“RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)”，并可能為白血病的治療提供新的靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1臨床資料

93例AML患兒的骨髓標(biāo)本(包括初治組75例，部分緩解組8例，完全緩解組10例)來(lái)源于中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院和孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院2006～2010年的住院病人，其中男54例，女39例，中位年齡8歲。全部病例均經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫分型、染色體、融合基因檢查確診。早幼粒細(xì)胞白血病基因與維甲酸受體α重排(promyelocytic leukemia-retinoic acid receptor α，PML-RARα)陽(yáng)性的急性早幼粒細(xì)胞白血病(即M3型)患兒誘導(dǎo)化療采用全反式維甲酸+米托蒽醌方案，其余的AML患兒誘導(dǎo)化療采用米托蒽醌+阿糖胞苷+順鉑方案。對(duì)照組采用特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)患兒，共12例，包括男7例，女5例，中位年齡6歲，AML患兒的詳細(xì)臨床資料見(jiàn)表1。本研究所有樣品的采集得到了中山大學(xué)道德倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

表1 AML患兒臨床資料

FAB：French-American-British classfication. M1：acute myelocytic leukemia without differentiation；M2：acute myelocytic leukemia with differentiation；M3：acute promyelocytic leukemia；M4：acute myelomonocytic leukemia； M5：acute monoblastic leukemia.

2miRNA基因芯片表達(dá)譜分析

按照說(shuō)明書(shū)方法用RNAiso(TaKaRa)試劑提取兒童AML組及對(duì)照組骨髓細(xì)胞總RNA，用miRNA基因芯片(博奧，北京)進(jìn)行miRNA微陣列分析。具體方法參考文獻(xiàn)[10]。

3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人白血病細(xì)胞系HL-60購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。將細(xì)胞接種于10%胎牛血清(Gibco)、無(wú)抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)中, 置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)按照每孔1×106細(xì)胞，1 mL完全培養(yǎng)基，接種于24孔板中。與miR-125b成熟體互補(bǔ)的反義寡核苷酸(anti-miR-125b)及陰性對(duì)照(anti-miR-NC)購(gòu)自廣州銳博公司。利用電轉(zhuǎn)系統(tǒng)(Neon? Transfection System，Invitrogen)將100 pmol anti-miR-125b和anti-miR-NC以10 μL體系轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)。電轉(zhuǎn)染條件如下：1 350 V，30 ms，1 pulse。

4qRT-PCR驗(yàn)證miR-125b的表達(dá)

采用RNAiso(TaKaRa)法分離純化各組臨床樣品的總RNA，分光光度法測(cè)定計(jì)算提取的總RNA含量及濃度。采用含有莖環(huán)樣的反轉(zhuǎn)錄引物(GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACAAG)，按照M-MLV reverse transcriptase試劑盒(Promega)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，體系如下：總RNA 5 μL，miR-125b RT primer 1.8 μL，U6 RT primer 1.8μL，dNTP 5 μL，5×M-MLV reverse transcriptase buffer 6 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶0.25 μL，RNA酶抑制劑 0.6 μL，補(bǔ)充DEPC水至30 μL。16 ℃孵育30 mim，42 ℃孵育45 min, 85 ℃加熱 5 min 失活逆轉(zhuǎn)錄酶，-4 ℃貯存。實(shí)時(shí)定量PCR按照SYBR? Premix Ex TaqTMII試劑盒(TaKaRa)說(shuō)明書(shū)操作。用Bio-Rad熒光PCR儀及其分析軟件iQ5進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及定量分析。20 μL反應(yīng)體系含cDNA 2 μL，上、下游引物各0.4 μL，2×SYBR Mix 10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，加水至20 μL。PCR循環(huán)：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。每次擴(kuò)增均設(shè)內(nèi)參基因組和目的基因組以及2管空白對(duì)照組(由DEPC水代cDNA)。每一樣本均設(shè)3個(gè)重復(fù)。最后用2-ΔΔCt方法將與對(duì)照組對(duì)應(yīng)的每一個(gè)miRNA表達(dá)進(jìn)行分析，U6為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，包括無(wú)模板的空白對(duì)照。所用引物見(jiàn)表2。

表2 引物序列

5細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)(碧云天)檢測(cè)細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體是：用電轉(zhuǎn)法將等量的反義寡核苷酸anti-miR-125b和陰性對(duì)照anti-miR-NC轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，接種于24孔板中培養(yǎng)。分別在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h、96 h取出相同體積的細(xì)胞，接種于96孔板中，加入10 μL CCK-8，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm的吸光值(A)，630 nm作為參比波長(zhǎng)。按以下公式計(jì)算抑制率：抑制率(inhibition ratio，IR，%) =1-(實(shí)驗(yàn)組平均A450-實(shí)驗(yàn)組平均A630)/(對(duì)照組平均A450-對(duì)照組平均A630)×100%。

6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1基因芯片檢測(cè)兒童AML中miR-125b表達(dá)增高

miRNA芯片對(duì)9例初發(fā)兒童急性白血病和3例正常骨髓中miRNAs的表達(dá)譜結(jié)果顯示，在兒童AML初發(fā)患者中，miR-100、miR-125b、miR-335明顯高表達(dá)。其中miR-125b在兒童AML中的表達(dá)增高，約為正常對(duì)照的12倍。

2miR-125b在兒童AML治療前后的表達(dá)情況

結(jié)果顯示,miR-125b在兒童AML中表達(dá)上調(diào)約16.6倍，其表達(dá)水平顯著高于正常組(P<0.01)，見(jiàn)圖1，與前期芯片的結(jié)果相符。miR-125b在8例部分緩解樣品中的表達(dá)降低，明顯低于初發(fā)AML樣品(P<0.01)，見(jiàn)圖1，而在10例完全緩解組中的表達(dá)更低，基本恢復(fù)到了正常組水平，與正常組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖1。

圖1ITP患者、初發(fā)AML患兒、部分緩解及完全緩解患兒miR-125b的差異表達(dá)

3anti-miR-125b抑制HL-60體外增殖

結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，anti-miR-125b反義寡核苷酸組的HL-60細(xì)胞增殖活性明顯受到抑制。轉(zhuǎn)染24 h后，細(xì)胞被抑制的情況不是很明顯(抑制率為3.8%)，48 h后，對(duì)照組仍正常增殖生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染了anti-miR-125b的實(shí)驗(yàn)組則生長(zhǎng)停滯，甚至有細(xì)胞數(shù)量減少的趨勢(shì)，48 h、72 h和96 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖的抑制率分別是33.3%、52.9%和56.6%。該結(jié)果提示，anti-miR-125b顯著抑制HL-60細(xì)胞的增殖 (P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2反義寡核苷酸anti-miR-125b對(duì)白血病細(xì)胞系HL-60增殖的影響

討 論

盡管目前對(duì)白血病的治療取得很大進(jìn)展，仍有相當(dāng)部分兒童白血病預(yù)后惡劣，因此，尋找白血病新的治療靶點(diǎn)，研發(fā)具有自主產(chǎn)權(quán)、毒副作用小的治療白血病的新藥具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。隨著對(duì)miRNA功能以及調(diào)控機(jī)理研究的闡明，以miRNA為靶點(diǎn)的抗腫瘤寡核苷酸藥物的研發(fā)成為了國(guó)際上的研究熱點(diǎn)，它將區(qū)別于常規(guī)的腫瘤治療，成為新一代的腫瘤基因治療藥物。因此，闡明腫瘤相關(guān)miRNA的功能具有重要意義，它可能為腫瘤治療提供新的靶點(diǎn)[11-12]。

miR-125b是調(diào)控線蟲(chóng)時(shí)空發(fā)育的miRNA——lin4的同源基因，它有2個(gè)不同的前體成員，分別是miR-125b-1和miR-125b-2。最新研究表明，AML中成熟的miR-125b主要來(lái)源于miR-125b-1[13]，而miR-125b-1前體位于11號(hào)染色體的脆性位點(diǎn)區(qū)[14]。隨著對(duì)miRNA研究的深入，miR-125b功能報(bào)道逐漸增多。它不僅在人類(lèi)發(fā)育過(guò)程起作用，如miR-125b通過(guò)靶向調(diào)控靶基因DGAT1、SGPL1、TBC1D1等調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞分化[15]；而且在癌癥發(fā)生中也發(fā)揮重要作用, Zhou等[16]最近報(bào)道m(xù)iR-125b能通過(guò)靶向結(jié)合bak的3’-UTR區(qū)域，抑制其蛋白的轉(zhuǎn)錄后翻譯，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡。本研究通過(guò)芯片和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)兒童急性髓系白血病患者中miR-125b的表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)miR-125b在兒童AML中顯著高表達(dá)，治療后部分緩解患者下降，而完全緩解的患者下降到正常水平，說(shuō)明miR-125b很可能在兒童AML中發(fā)揮了重要作用。進(jìn)一步對(duì)其功能進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b的反義寡核苷酸小分子能夠有效抑制HL-60細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果與Zhou等在乳腺癌中的研究結(jié)果相似，我們推測(cè)miR-125b很可能在兒童AML的發(fā)生中也起著癌基因作用，至于miR-125b是否也是通過(guò)抑制靶基因bak而發(fā)揮作用正在研究之中。

本文研究了miR-125b在兒童AML中的表達(dá)及功能，為利用反義核酸技術(shù)開(kāi)展針對(duì) miR-125b的靶向治療成為可能，從而為白血病的基因治療開(kāi)辟新的途徑。但是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因參與、逐步演化的復(fù)雜過(guò)程，因此對(duì)于miR-125b引起上述改變的具體機(jī)制和作用靶點(diǎn)還需進(jìn)一步的研究，以期為理解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制、尋找有效的腫瘤治療靶標(biāo)和方法打下基礎(chǔ)。

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ExpressionofmiR-125binpediatricacutemyeloidleukemiaandtheeffectofanti-miR-125boligonucleotideonproliferationofhumanleukemiccells

LIU Xiao-dan1, XU Ling2, TAN Wei-ping3, YAN Mu-xia2

(1TheCenterofMedicalResearch,3DepartmentofPediatrics,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China;2DepartmentofHematology,GuangzhouWomenandChildren’sMedicalCenter,Guangzhou510623,China.E-mail:luoxul64@yahoo.com)

AIM: To investigate the expression of miR-125b in pediatric acute myeloid leukemia (AML), and to explore the inhibitory effect of anti-miR-125b oligonucleotide on human leukemic cells.METHODSThe expression of miRNAs in pediatric AML bone marrow cells was analyzed by gene microarray and real-time quantitative PCR. HL-60 cells were transfected with anti-miR-125b, which was complementary to miR-125b in sequence, and the viability of HL-60 cells was measured by CCK-8 assay 24 h, 48 h, 72 h and 96 h after electroporation.RESULTSThe expression levels of miR-125b in the cells of newly diagnosed pediatric AML patients was almost 12 times as high as that in the cells of idiopathic thrombocytopenic purpura cases.However， the decreased levels of miR-125b in the cells of partial remission patients and returned to normal in the cells of completely remission patients were observed. At the same time, the growth rate of the cells treated with anti-miR-125b oligonucleotide was obviously decreased compared with that of control cells.CONCLUSIONmiR-125b may take effect as an oncogene in pediatric AML. Anti-miR-125b oligonucleotide may be useful as a new drug for treating pediatric AML.

miR-125b; Oligonucleotides,antisense; HL-60 cells

R342.7

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.029