氧化應(yīng)激在糖尿病大鼠胃動力變化中的意義*

金啟輝， 管文花， 王 輝， 朱延濤， 陳懷紅， 婁域峰， 陳 瑛

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 1老年病科, 5干部保健科， 浙江 杭州 310009；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院2血液科， 4檢驗科，浙江 杭州 310003； 3浙江中醫(yī)藥大學(xué)科研處， 浙江 杭州 310035)

1000-4718(2012)12-2238-06

2012-04-28

2012-10-16

浙江省衛(wèi)生廳項目(No.N20100767)；浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目(No.2010ZB076)

△通訊作者 Tel：0571-87783703；E-mail:z2chengying@126.com

氧化應(yīng)激在糖尿病大鼠胃動力變化中的意義*

金啟輝1， 管文花2， 王 輝3， 朱延濤3， 陳懷紅1， 婁域峰4， 陳 瑛5△

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院1老年病科,5干部保健科， 浙江 杭州 310009；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院2血液科，4檢驗科，浙江 杭州 310003；3浙江中醫(yī)藥大學(xué)科研處， 浙江 杭州 310035)

目的觀察糖尿病大鼠胃組織中氧化應(yīng)激水平，探討氧化應(yīng)激對糖尿病胃動力和胃Cajal間質(zhì)細胞(ICC)的影響。方法38只8周齡雄性SD大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，選取造模成功的36只大鼠分為糖尿病組和糖尿病治療組，每組18只,另取同批正常SD大鼠18只作為正常對照組。檢測各組大鼠體重、血糖和糖化血紅蛋白。實驗第1周末和第10周末分別處死各組9只大鼠測定胃排空率，以及胃平滑肌中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、酪氨酸激酶受體c-Kit和干細胞因子(SCF)水平。通過免疫細胞化學(xué)和原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測胃組織ICC凋亡。結(jié)果與正常組比較，糖尿病大鼠胃動力明顯減弱。糖尿病大鼠胃平滑肌內(nèi)MDA含量升高，SOD活性減弱，TNF-α含量升高，c-Kit和SCF水平下降，ICC凋亡明顯增加。糖尿病大鼠治療后氧化應(yīng)激水平降低，抗氧化能力提高，c-Kit和SCF水平顯著升高，ICC凋亡減少。抗氧化治療后胃動力明顯改善，與糖尿病組比較有明顯差異。結(jié)論高血糖影響大鼠胃組織中抗氧化酶的表達。氧化應(yīng)激水平在糖尿病胃組織中明顯增強，在糖尿病大鼠胃動力變化中發(fā)揮重要作用。氧化應(yīng)激促使c-Kit/SCF系統(tǒng)受損，導(dǎo)致胃平滑肌ICC凋亡增多。

糖尿??； 氧化性應(yīng)激； 胃動力

糖尿病患者發(fā)生胃動力障礙的發(fā)病機制較多，主要有胃腸神經(jīng)病變、高血糖、胃腸激素分泌異常以及微血管病變等。然而，糖尿病患者機體的氧化和抗氧化體系失衡，導(dǎo)致氧自由基增多，氧化應(yīng)激增強，是糖尿病各種并發(fā)癥如神經(jīng)病變、腎臟病變、視網(wǎng)膜等病變的重要原因[1]，但關(guān)于氧化應(yīng)激對糖尿病胃動力的影響鮮有報道。本實驗以糖尿病大鼠模型為研究對象，觀察胃平滑肌組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、干細胞因子(stem cell factor,SCF)、酪氨酸激酶受體c-Kit和Cajal間質(zhì)細胞(interstitial cell of Cajal，ICC)的水平，分析探討氧化應(yīng)激對胃動力的影響及發(fā)病機制。

材 料 和 方 法

1動物

SPF級SD大鼠，雄性，8周齡，160～180 g，由上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證為SCXK(滬)2008-0016，飼養(yǎng)環(huán)境許可證號為SYXK(浙)2003-0003。

2主要試劑

鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)購自Sigma；SOD、MDA和糖化血紅蛋白檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；大鼠TNF-α、SCF和c-Kit ELISA試劑盒購自上海阜康生物技術(shù)有限公司。c-Kit單克隆抗體、Cy3標(biāo)記兔抗大鼠IgG抗體和TUNEL試劑盒購自北京嘉美紐諾生物科技有限公司。

3主要方法

3.1糖尿病大鼠模型的建立和分組 雄性SD大鼠56只，分為正常對照(control，C)組大鼠18只和糖尿病建模大鼠38只。正常組大鼠給予基礎(chǔ)飼料，建模大鼠給予高脂飼料(豬油18%，蔗糖20%，蛋黃3%，基礎(chǔ)飼料59%)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食12 h后，正常對照組大鼠一次性尾靜脈注射40 mL/kg 0.1%檸檬酸緩沖液(檸檬酸-檸檬酸鈉按1∶1.32配制成檸檬酸緩沖液，pH 4.5)，建模組大鼠一次性尾靜脈注射40 mL/kg 1%STZ檸檬酸緩沖液。注射STZ 72 h后，不同時間2次隨機空腹血糖≥16.7 mmol/L確認(rèn)為糖尿病模型成功。

模型穩(wěn)定1周后開始實驗。成模的糖尿病大鼠36只，隨機分為2組，即抗氧化劑硫辛酸治療(diabetes millitus plus thioctic acid treatment,DT)組和糖尿病模型(diabetes millitus,DM)組，每組各18只。于實驗第1周末隨機處死C組大鼠9只，DM組大鼠9只，DT組大鼠9只，取血和胃組織。實驗第10周結(jié)束時處死C組大鼠9只，DM組大鼠9只，DT組大鼠9只，取血和胃組織。

3.2給藥方法 給藥組每只大鼠給予硫辛酸100 mg/kg灌胃，DM組和C組則給予同體積的生理鹽水灌胃，每天給藥1 次。

3.3檢測指標(biāo)及方法

3.3.1胃排空率測定[2]大鼠禁食不禁水16 h后，給予1.5 mmol/L的酚紅溶液2 mL灌胃，15 min后處死大鼠。剖腹，結(jié)扎賁門和幽門，取胃，沿胃大彎切開，以蒸餾水沖洗胃內(nèi)容物，定容為20 mL，加入0.5 mol/L NaOH 20 mL攪拌混勻，靜置1 h，取5 mL上清液加入20%三氯乙酸0.5 mL去蛋白，以3 500 r/min離心10 min，取上清液。用分光光度計在560 nm波長下測定吸光度值；另取酚紅溶液2 mL，先后加入蒸餾水18 mL、0.5 mol/L NaOH 20 mL和20%三氯乙酸4 mL攪拌混勻，測定吸光度值。按公式計算大鼠胃排空率(%)=(1-實測酚紅吸光度值/標(biāo)準(zhǔn)酚紅吸光度值)×100%。

3.3.2體重檢測 每周一上午空腹測體重1次。

3.3.3血糖檢測 每周一、三、五上午8點用血糖儀(強生公司One-Touch Ultra)鼠尾取血測空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)。

3.3.4糖化血紅蛋白測定 處死大鼠后腹主動脈取血，取紅細胞制備溶血液，高壓液相法測定糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c)含量。

3.3.5胃平滑肌組織中SOD活性和MDA含量檢測 取胃平滑肌組織勻漿，MDA含量采用改良的硫代巴比妥酸法，SOD活性采用黃嘌呤氧化法。具體操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

3.3.6胃平滑肌組織中TNF-α、c-Kit和SCF含量檢測 取胃平滑肌組織勻漿，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)。具體操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

3.3.7免疫細胞化學(xué)染色法 取部分胃組織，0.01 mol/L PBS沖洗，100%丙酮固定胃20 min，解剖顯微鏡下，用鑷子撕去胃的黏膜層和黏膜下層，獲得胃平滑肌肌層鋪片。PBS漂洗3次，每次5 min。1%BSA孵育30 min后加入第Ⅰ抗體，c-Kit單克隆抗體4 ℃，48 h；Cy3標(biāo)記的兔抗大鼠IgG抗體25 ℃，60 min。水溶性封片劑封片觀察。

3.3.8TUNEL 法檢測胃ICC凋亡指數(shù) 采用TUNEL檢測試劑盒，按上述方法鋪片，4%多聚甲醛固定(20 min，室溫)，0.1%Triton X-100和0.01 mol/L PBS處理20 min，TUNEL液由45 μL標(biāo)記液和5 μL酶溶液組成，37 ℃避光孵育1 h，0.01 mol/L PBS漂洗3次，封片后觀察。細胞核中有黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡細胞。每張切片選取陽性細胞數(shù)最多的視野，計算5個高倍視野(×400)下的凋亡細胞數(shù)，以凋亡細胞/100個細胞表示凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI)，計算每100個ICC細胞中陽性細胞數(shù)量。

4統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1各組大鼠體重、空腹血糖和糖化血紅蛋白的變化

實驗開始時3組大鼠體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。實驗第1周結(jié)束時 DM組和DT組大鼠體重增加較C組略明顯，但3組間無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與C組比較，F(xiàn)BG和HbA1c在DM組和DT組顯著升高(P<0.01)。實驗第10周結(jié)束時，C組體重增加較DM組和DT組明顯(P<0.01)。DM組和DT組的FBG和HbA1c水平顯著高于C組(P<0.01)。DM組和DT組的體重、FBG和HbA1c水平在實驗第1周和第10周結(jié)束時均無顯著差異(P>0.05)，說明抗氧化治療對大鼠的體重和血糖無明顯影響，見表1。

表1各組大鼠體重、空腹血糖和糖化血紅蛋白的比較

Time(week)GroupWeight(g)FBG(mmol/L)HbA1c(%)1C188±94.5±0.45.27±0.56DM194±1111.7±1.9**12.50±2.14**DT194±911.5±1.6**12.30±2.12**10C449±274.7±0.55.38±0.58DM303±19**13.4±1.9**13.40±2.33**DT337±22**11.6±1.2**11.10±2.09**

C:control;DM:diabetes mellitus;DT: diabetes millitus plus thioctic acid treament.**P<0.01vsC group.

2各組大鼠胃排空率的比較

實驗第1周結(jié)束時，C組、DM組和DT組3組大

鼠胃排空率分別是(77.25±3.71)%、(80.37±5.36)%和(78.42±4.11)%，組間比較無顯著差異(P>0.05)。實驗第10周結(jié)束時，C組、DM組和DT組3組大鼠胃排空率分別是(75.71±3.48)%、(53.68±4.79)%和(68.44±3.89)%；與C組相比， DM組胃排空率顯著降低(P<0.01)，DT組無顯著差異(P>0.05)；與DT組相比，DM組胃排空率顯著降低(P<0.01)，說明抗氧化治療后胃動力得到明顯改善，見圖1。

圖1第1周和第10周時各組大鼠胃排空率的比較

3各組大鼠胃平滑肌中MDA和SOD水平比較

實驗第1周結(jié)束MDA水平在DM組和DT組顯著高于C組(P<0.05)，SOD水平DM組和DT組顯著低于C組(P<0.05)，MDA和SOD在DM組和DT組間無顯著差異(P>0.05)。第10周結(jié)束MDA水平在C組和DT組實驗前后無明顯變化，顯著低于DM組(P<0.01)，SOD水平C組最高，DT組次之，DM組最低，組間有顯著差異(P<0.05或P<0.01)，提示DT組治療后氧化應(yīng)激水平較DM組顯著下降(P<0.01)，抗氧化能力增強(P<0.05)，見圖2A、B。

圖2第1周和第10周各組大鼠胃平滑肌SOD、MDA、TNF-α、c-Kit及SCF水平的比較

4各組大鼠胃平滑肌中TNF-α水平比較

實驗第1周結(jié)束時TNF-α水平在各組間無明顯差異(P>0.05)。第10周結(jié)束時TNF-α水平在DM組和DT組高于C組(P<0.05)，TNF-α在DM組較DT組升高明顯(P<0.05)，提示治療后DT組炎癥因子TNF-α水平較DM組有下降，見圖2C。

5各組大鼠胃平滑肌中c-Kit和SCF含量比較

實驗第1周c-Kit水平在各組間無顯著差異(P>0.05)，SCF水平與C組比較，DM組和DT組有顯著下降(P<0.05)。第10周后與C組比較，c-Kit和SCF水平在DM組和DT組有不同程度下降，其中DM組下降更明顯，組間有顯著差異(P<0.05或P<0.01)，見圖2D、E。

6各組大鼠胃平滑肌組織中ICC的AI比較

TUNEL染色凋亡標(biāo)記細胞核著黃色，c-Kit染色陽性紅色為ICC細胞，c-Kit/TUNEL雙重染色綠色標(biāo)記為ICC凋亡細胞。圖3為第10周結(jié)束時各組ICC凋亡圖比較，可見DM組出現(xiàn)大量綠色標(biāo)記ICC凋亡細胞，DT組較DM組少，C組最少。

AI的觀察發(fā)現(xiàn)，第1周結(jié)束時，C組、DM組、DT組AI分別是(7.9±1.7)%、(9.7±2.1)%和(9.2±1.9)%，明顯高于對照組(P<0.05)。第10周后C組、DM組、DT組AI分別是(8.5±2.2)%、(21.2±5.7)%和(12.4±4.1)%，組間有顯著差異(P<0.05或P<0.01)，提示DM組凋亡更明顯，DT組治療后有改善，見圖3。

圖3大鼠胃平滑肌ICC凋亡表現(xiàn)

討 論

氧化應(yīng)激是糖尿病糖毒性發(fā)生的主要致病機制之一，高血糖誘發(fā)的氧化應(yīng)激被認(rèn)為參與糖尿病的各種慢性并發(fā)癥[3]。本研究發(fā)現(xiàn)伴隨著糖尿病大鼠胃動力下降，糖尿病大鼠胃平滑肌組織中氧化應(yīng)激(MDA)水平升高和抗氧化能力(SOD)下降。給予硫辛酸抗氧化治療10周后，血糖無明顯變化，胃平滑肌內(nèi)MDA減少，SOD活性提高，胃動力明顯恢復(fù)，表明通過抗氧化能減輕糖尿病大鼠的胃損傷，改善胃動力，從而說明氧化應(yīng)激對糖尿病胃動力有重要影響。

ICC是分布在消化道自主神經(jīng)末梢與平滑肌細胞之間的一類特殊細胞，發(fā)出慢波，通過縫隙連接傳播到平滑肌細胞，產(chǎn)生動作電位，引起平滑肌收縮，故被認(rèn)為是胃腸道起搏細胞。因具有產(chǎn)生、傳播慢波、傳導(dǎo)胃腸神經(jīng)系統(tǒng)至平滑肌信號的功能，其在胃腸道疾病中的重要作用已被廣泛關(guān)注[4-5]。近年研究發(fā)現(xiàn)糖尿病胃動力障礙大鼠胃平滑肌組織中ICC數(shù)量及細胞內(nèi)細胞器的數(shù)量均明顯減少[6-7]，糖尿病胃動力變化與ICC減少、電節(jié)律紊亂有關(guān)[8]。本實驗研究顯示，第1周時3組大鼠ICC凋亡指數(shù)無顯著差異，胃排空率未受明顯影響。早期糖尿病大鼠胃排空的加快研究認(rèn)為與早期高血糖及下丘腦中g(shù)hrelin含量及其受體表達增多使胃排空加速[9]有關(guān)。隨著病程進展，第10周DM組ICC凋亡指數(shù)顯著高于C組和DT組，胃排空率顯著減慢，說明糖尿病胃動力變化與ICC數(shù)量減少有關(guān)。進一步觀察氧化應(yīng)激水平與ICC的相關(guān)性，DM組氧化應(yīng)激水平最高，DT組治療后氧化應(yīng)激水平顯著下降，抗氧化治療后隨著氧化應(yīng)激水平的下降，ICC凋亡明顯減少。而類似相關(guān)報道也提示抗氧化治療能保護ICC并改善胃動力，如血紅素加氧酶-1能通過保護ICC而有效逆轉(zhuǎn)糖尿病鼠胃輕癱[10]，鋅原卟啉能使糖尿病大鼠結(jié)腸ICC數(shù)量增加，胃腸動力加快[11]。說明胃動力減退與ICC凋亡有關(guān)，而抗氧化治療能減少ICC細胞凋亡，從而改善胃動力。

分析氧化應(yīng)激是通過影響胃ICC凋亡的途徑，實驗進一步檢測胃組織中c-Kit和SCF含量。目前糖尿病胃組織ICC凋亡的病理機制主要認(rèn)為是胰島素分泌減少，胰島素信號減弱，c-Kit/SCF減少。SCF是ICC特異性標(biāo)志物酪氨酸激酶受體c-Kit的配體，是一種重要的多功能生長因子，與c-Kit結(jié)合組成c-Kit/SCF信號系統(tǒng)對ICC表型維持、功能分化具有重要作用[7]。很多研究證實外源性給予SCF或胰島素對糖尿病結(jié)腸ICC異常有一定的改善或逆轉(zhuǎn)作用[12-15]。本研究發(fā)現(xiàn)DM組大鼠胃平滑肌組織中c-Kit和SCF表達明顯下調(diào)。早期胃動力、ICC凋亡指數(shù)未受影響時，胃平滑肌組織中SCF已開始下降。隨著疾病進展，c-Kit和SCF表達進一步下降，ICC凋亡增多。通過抗氧化治療10周后，氧化應(yīng)激水平下降，c-Kit/SCF表達有明顯提高，ICC凋亡數(shù)量減少，胃動力得到顯著改善。研究結(jié)果提示c-Kit/SCF信號系統(tǒng)受損是導(dǎo)致ICC凋亡，數(shù)量減少的重要原因之一，而c-Kit/SCF信號系統(tǒng)受損因氧化應(yīng)激水平增強。

此外，本實驗觀察炎癥因子TNF-α的變化，發(fā)現(xiàn)在第1周時3組水平無差異，第10周時DM組TNF-α明顯升高，而DT組升高不明顯，但較C組仍有輕度升高，分析是由于高糖促使氧化應(yīng)激發(fā)生，氧化應(yīng)激誘發(fā)TNF-α表達增加。既往也有研究表明 TNF-α可促進氧化應(yīng)激水平增強，說明慢性的低度炎癥狀態(tài)與高氧化應(yīng)激水平密切相關(guān)[16]。TNF-α在促進細胞凋亡中也有重要的意義[17]。說明氧化應(yīng)激與炎癥因子之間互相促進，形成惡性循環(huán)，嚴(yán)重影響ICC增殖，從而促使糖尿病胃動力的改變。

綜上述，本實驗發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠胃平滑肌組織氧化應(yīng)激程度明顯增強，氧化應(yīng)激通過誘導(dǎo)c-Kit/SCF表達減少，促進ICC凋亡。而抗氧化治療后隨著氧化應(yīng)激水平的下降，c-Kit/SCF含量升高，ICC凋亡數(shù)量下降，胃動力改善。實驗研究表明氧化應(yīng)激在糖尿病大鼠胃動力改變中有著重要的作用。

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Roleofoxidativestressingastricmotilityofdiabeticrats

JIN Qi-hui1, GUAN Wen-hua2, WANG Hui3, ZHU Yan-tao3, CHEN Huai-hong1, LOU Yu-feng4, CHEN Ying5

(1DepartmentofGeriatrics,5DepartmentofOfficerHealth,SecondAffiliatedHospitalofZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310009,China;2DepartmentofHematology,4DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310003,China;3DepartmentofResearch,ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310035,China.E-mail:z2chengying@126.com)

AIM: To investigate the changes of oxidative stress in the stomach tissues and their roles in gastric motility and interstitial cells of Cajal (ICC) in diabetic rats.METHODSThirty-eight SD rats (8-week-old, male) were intraperitoneally injected with streptozotocin (STZ). Diabetes was successfully induced in 36 of them. The diabetes rats were randomly divided into untreated diabetes group and treated diabetes group. Eighteen healthy SD rats (8-week-old, male) served as controls. The body weight and the levels of blood glucose and glycosylated hemoglobin were measured. At the end of week 1 and week 10, 9 rats were sacrificed in each group. The gastric emptying rate and the levels of malondialdehyde (MDA),superoxide dismutase (SOD), tumor necrosis factor α (TNF-α), tyrosine kinase receptor c-Kit and stem cell factor (SCF) in gastric smooth muscle were analyzed. The apoptosis of ICC in gastric tissues was detected by the methods of immunocytochemistry and TUNEL.RESULTSCompared with control group, gastric motility and SOD activity in untreated diabetes group were significantly weakened, the levels of MDA and TNF-α increased, the levels of c-Kit and SCF decreased, and apoptosis of ICC enhanced. In treated diabetes group, the oxidative stress level was attenuated, antioxidant capacity was enhanced, the levels of c-Kit and SCF were significantly increased, and the ICC apoptosis was reduced. Gastric motility was significantly improved after antioxidant therapy.CONCLUSIONHyperglycemia affects the expression of antioxidant enzymes in the stomachs of diabetic rats. Oxidative stress is caused by hyperglycemia and is an important factor in the etiology of gastric motility dysfunction in diabetic rats, which may be correlated with the augmentation of ICC apoptosis resulting from oxidative stress-induced c-Kit/SCF damage.

Diabetes mellitus; Oxidative stress; Gastric motility

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.12.023