DLL4在胰腺癌組織中的表達(dá)及其與腫瘤血管生成的關(guān)系

徐桂芳 張偉杰 孫琦 楊軍 周志華 趙海濱 鄒曉平

·論著·

DLL4在胰腺癌組織中的表達(dá)及其與腫瘤血管生成的關(guān)系

徐桂芳 張偉杰 孫琦 楊軍 周志華 趙海濱 鄒曉平

目的檢測delta-like ligand 4(DLL4)在胰腺癌中的表達(dá)，分析其與腫瘤血管生成及臨床病理特征的關(guān)系。方法采用免疫組化SP法檢測60例胰腺癌組織及20例癌旁正常胰腺組織中DLL4的表達(dá)；觀察微血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34表達(dá),計(jì)算微血管密度(MVD)；分析DLL4表達(dá)、MVD與胰腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系以及兩者的相關(guān)性。結(jié)果DLL4在胰腺癌組織中的表達(dá)明顯高于正常胰腺組織(68.3%比20.0%,P<0.01)；胰腺癌組織DLL4的高表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分型、腫瘤轉(zhuǎn)移及浸潤等呈正相關(guān)(P值均<0.05),而與腫瘤部位、大小、組織病理分型無關(guān)。胰腺癌組織MVD明顯高于正常胰腺組織(34.9±13.2比18.9±2.2,P<0.01)；胰腺癌的MVD與腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤轉(zhuǎn)移及浸潤有關(guān)(P值均<0.05)，而與腫瘤部位、大小、組織病理分型等無明顯相關(guān)性。DLL4表達(dá)陽性的胰腺癌組織MVD明顯高于DLL4表達(dá)陰性者(38.8±10.7比29.0±15.2,P<0.05)，且DLL4表達(dá)與MVD呈顯著正相關(guān)(r=0.669,P<0.05)。結(jié)論DLL4表達(dá)可促進(jìn)腫瘤血管生成,且與胰腺癌的轉(zhuǎn)移、浸潤相關(guān)。

胰腺腫瘤; DLL4; 微血管密度; 淋巴結(jié); 腫瘤轉(zhuǎn)移; 免疫組織化學(xué)

Notch信號途徑是由多種分子參與的復(fù)雜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路, 通過調(diào)節(jié)相鄰細(xì)胞之間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞發(fā)育。在哺乳動物細(xì)胞中，Notch信號通路包含5種跨膜Notch配體[Jagged1、2及Delta-like ligand(DLL)1、3、4]和4種Notch受體(Notch1、2、3、4)[1]。其中DLL4作為內(nèi)皮細(xì)胞特異性配體,在血管的新生、發(fā)育和成熟過程中起主要作用[2]。本研究檢測胰腺癌組織DLL4表達(dá)，探討其與微血管密度(microvessel density, MVD)及胰腺癌病理特征的相關(guān)性。

材料和方法

一、研究對象

收集南京鼓樓醫(yī)院2000年10月至2002年8月手術(shù)切除的胰腺癌標(biāo)本60例,其中男性42例,女性18例；年齡39～72歲，中位年齡63歲。另取其中20例切除遠(yuǎn)端的正常胰腺組織作為對照。病理診斷與分類依據(jù)國際抗癌聯(lián)合會的TNM臨床分類。

二、DLL4蛋白及MVD檢測

采用免疫組化染色法，按SP超敏試劑盒(KIT29709，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)說明書操作。兔抗人DLL4多抗及CD34單抗購自Abcam公司，工作濃度1∶100；二氨聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)酶底物顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。用PBS替代一抗作陰性對照。由兩位病理科醫(yī)師雙盲法閱片，每張切片選取5個400倍視野，每個視野計(jì)數(shù)100個腫瘤細(xì)胞，胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為DLL4陽性染色，陽性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性，≥10%為陽性表達(dá)。

CD34表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜,每一個染成棕黃色的、可與周圍血管和腫瘤細(xì)胞及其他結(jié)締組織區(qū)分開來的明顯微小血管腔或含3個以上內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞簇,不論管腔和紅細(xì)胞出現(xiàn)與否,均作為一個單一的、可計(jì)數(shù)的微血管。管腔面積>8個紅細(xì)胞直徑,帶有較厚肌層的微血管均不計(jì)數(shù)[3]。先于低倍鏡下確定3個血管著色最密集區(qū)域,然后在100倍視野下計(jì)數(shù)3個視野的微血管數(shù)目,取均值作為MVD。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺癌及正常胰腺組織DLL4的表達(dá)

胰腺癌組織DLL4的表達(dá)率為68.3%(41/60),正常胰腺的表達(dá)率為20.0%(4/20)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，圖1)。胰腺癌DLL4表達(dá)與患者性別、年齡及腫瘤部位、大小、組織病理分型均無關(guān)，而與腫瘤分化程度、TNM分型、腫瘤轉(zhuǎn)移及浸潤等呈正相關(guān)(P值均<0.05，表1)。

二、胰腺癌及正常胰腺組織的MVD

60例胰腺癌組織的MVD為34.9±13.2,正常胰腺組織為18.9±2.2，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2)。MVD與胰腺癌的腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤轉(zhuǎn)移及浸潤均有關(guān)(P<0.05)。而與患者性別、年齡及腫瘤部位、大小、組織病理分型等均無關(guān)(表1)。

圖1 胰腺癌(a)與正常胰腺組織(b)DLL4表達(dá)(×400)

圖2 胰腺癌(a)與正常胰腺組織(b)的MVD(×400)

表1胰腺癌組織DLL4表達(dá)、MVD與臨床病理特征的關(guān)系

病理特征例數(shù)DLL4陽性[例,率(%)]P值MVD(x±s)P值年齡(歲)0.5280.797 <602818(64.3)33.8±12.6 ≥603223(71.9)35.9±12.9性別0.2110.122 男3421(61.8)34.1±12.1 女2620(76.9)36.0±14.7腫瘤部位0.0950.360 胰頭5137(72.5)35.0±12.6 胰體尾94(44.4)34.3±17.1分化程度0.0220.049 低分化2219(86.4)42.9±8.7 中高分化3822(57.9)30.2±13.2組織病理分型0.1100.329 導(dǎo)管細(xì)胞腺癌5135(68.6)35.7±13.5 乳頭狀腺癌75(71.4)31.0±12.1 其他類型癌21(50.0)28.0±7.7腫瘤大小(cm)0.0710.650 ≤2.5115(45.5)31.8±13.1 >2.54936(73.5)35.6±13.2腫瘤累及范圍0.0070.046 T1～T22915(51.7)23.8±4.9 T3～T43126(83.9)45.3±9.4淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.0130.045 N02412(50.0)29.3±9.8 N13629(80.6)38.6±13.9TNM臨床分期0.0340.038 Ⅰ～Ⅱ2312(52.2)25.0±7.9 Ⅲ～Ⅳ3729(78.4)41.1±12.0

三、胰腺癌組織DLL4表達(dá)與MVD的相關(guān)性

DLL4表達(dá)陽性的胰腺癌組織的MVD為38.8±10.7，DLL4表達(dá)陰性的胰腺癌組織的MVD為29.0±15.2，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.038)。胰腺癌組織DLL4表達(dá)與MVD呈顯著正相關(guān)(r=0.669,P<0.05)。

討 論

文獻(xiàn)報(bào)道，血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Notch1和Notch4受體及jagged1、DLL1和DLL4配體，且腫瘤血管和腫瘤細(xì)胞中也高表達(dá)DLL4，并活化Notch信號[4-5]。本結(jié)果顯示，胰腺癌組織高表達(dá)DLL4， DLL4的過表達(dá)與胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示DLL4高表達(dá)與胰腺癌的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。

MVD是衡量血管生成的定量指標(biāo)。Ikeda等[6]報(bào)道，MVD可作為胰腺癌臨床病理改變的獨(dú)立預(yù)后因素。章福彬等[7]報(bào)道，MVD與臨床病理特征關(guān)系密切，且與疾病進(jìn)展階段呈正相關(guān)。本結(jié)果顯示，胰腺癌MVD明顯高于正常胰腺組織，且與胰腺癌的浸潤、轉(zhuǎn)移相關(guān)，同樣提示MVD與胰腺癌的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。本結(jié)果還顯示，DLL4高表達(dá)與腫瘤組織MVD呈顯著正相關(guān)，表明DLL4的表達(dá)參與胰腺癌的血管生成過程。

文獻(xiàn)報(bào)道，抑制腫瘤組織中DLL4的過度表達(dá)將導(dǎo)致腫瘤組織生成大量無功能的新生血管，造成腫瘤組織血供不足，最終導(dǎo)致腫瘤生長受到抑制[8]?？笵LL4抗體也可以特異性阻斷Notch信號通路，抑制小鼠腫瘤生長。因此，DLL4現(xiàn)已經(jīng)成為腫瘤抗血管治療研究的新熱點(diǎn)。以DLL4為靶目標(biāo)的抗血管治療技術(shù)將為胰腺癌的綜合治療提供新的方法。

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Expressionofdeltalikeligand4inpancreaticcanceranditsrelationshipwithangiogenesis

XUGui-fang,ZHANGWei-jie,SUNQi,YANGJun,ZHOUZhi-hua,ZHAOHai-bin,ZOUXiao-ping.

DepartmentofGastroenterology,DrumTowerHospital，NanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing210008,China

ZOUXiao-ping,Email:zouxiaoping795@hotmail.com

ObjectiveTo detect the expression of delta-like ligand 4(DLL4) and its relation with the angiogenesis in pancreatic cancer.MethodsSP immunohistochemistry method was used to detect the expression of DLL4 in pancreatic cancer and para-cancerous tissue. The microvessel density (MVD) was calculated with CD34staining for microvessel endothelium and the correlation between expression of DLL4, MVD and clinicopathological parameters of pancreatic carcinoma was investigated.ResultsThe expression of DLL4 in pancreatic cancer was significantly higher than that in para-cancerous normal pancreatic tissue (68.3%vs20%,P<0.01). The over-expression of DLL4 in pancreatic cancer was positively related to the differentiation degree, TNM staging, metastasis and invasion (P<0.05), but not related to the location, tumor size and histological types. The MVD in pancreatic cancer tissues was significantly higher than that in para-cancerous normal tissues (34.9±13.2vs18.9±2.2,P<0.01). MVD was correlated with the differentiation degree, TNM staging, metastasis and invasion (P<0.05), but not with the tumor size and location, histological types. MVD in pancreatic cancer expressing DLL4 was significantly higher than that in pancreatic cancer not expressing DLL4 (38.8±10.7vs29.0±15.2,P=0.038), and the expression of DLL4 and MVD were positively correlated (r=0.669,P<0.05).ConclusionsDLL4 expression may play an important role in pancreatic carcinogenesis by promoting angiogenesis and may be associated with tumor invasion and metastasis.

Pancreatic neoplasm; Delta-like ligand 4; Microvessel density; Lymph nodes; Neoplasm metastasis; Immunohistochemistry

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.03.007

南京大學(xué)中央高?？蒲匈Y助項(xiàng)目(021414340038)；南京市青年基金項(xiàng)目(QYK11166)；南京市衛(wèi)生青年人才培養(yǎng)工程(寧衛(wèi)科[2011]32號)

210008 南京，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科(徐桂芳、鄒曉平)，科技處(張偉杰)，病理科(孫琦、楊軍)；解放軍第101醫(yī)院病理科(周志華、趙海濱)

鄒曉平，Email: zouxiaoping795@hotmail.com

2011-10-13)

(本文編輯：呂芳萍)