聚肌胞苷酸刺激的上皮細(xì)胞對(duì)成纖維細(xì)胞活化的影響及EMMPRIN的作用*

陳興無， 左 蓓， 張新紅

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽蕪湖241001)

氣道炎癥和重塑是哮喘患者的基本病理特征，其程度與疾病嚴(yán)重度呈正相關(guān);在慢性炎癥條件下，氣道壁成纖維細(xì)胞活化并轉(zhuǎn)分化為表達(dá)α－平滑肌肌動(dòng)蛋白(α －smooth muscle actin，α －SMA)、具收縮功能且分泌活躍的肌成纖維細(xì)胞［1］。哮喘反復(fù)發(fā)作促進(jìn)氣道炎癥和重塑，已知病毒感染是急性發(fā)作最常見的誘因［2］，其中鼻病毒(rhinovirus，RV)最常見而且是唯一與發(fā)作顯著相關(guān)的病原體。RV為單鏈RNA(single－stranded RNA，ssRNA)，在復(fù)制過程中生成雙鏈RNA(double－stranded RNA，dsRNA)，dsRNA的模擬合成物聚肌胞苷酸［polyinocinic－polycytidylic acid，poly(I:C)］模擬病毒感染通常用于研究病毒對(duì)多種細(xì)胞的影響。研究發(fā)現(xiàn)poly(I:C)破壞氣道上皮屏障，增加上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積［3－4］并誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞。體內(nèi)模型證實(shí)poly(I:C)增強(qiáng)抗原致敏，增加氣道炎性細(xì)胞浸潤并增強(qiáng)氣道高反應(yīng)性，表明RV在哮喘氣道重塑中發(fā)揮重要作用。然而，poly(I:C)在成纖維細(xì)胞活化過程中的作用機(jī)制目前仍不清楚。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)破壞ECM和細(xì)胞連接，促進(jìn)炎性細(xì)胞募集，成纖維細(xì)胞衍生的MMPs可調(diào)節(jié)纖維化反應(yīng)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞收縮。RV感染人支氣管上皮細(xì)胞增加MMP－9表達(dá)［5］，加重氣道損傷和重塑過程。細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)誘導(dǎo)鄰近細(xì)胞生成MMPs［6］，調(diào)節(jié)正常組織重構(gòu)和分化過程中MMPs表達(dá)以及存在肌成纖維細(xì)胞的非腫瘤狀態(tài)，提示EMMPRIN可能參與肌成纖維細(xì)胞分化。EMMPRIN可觸發(fā)細(xì)胞骨架重組形成收縮性應(yīng)力纖維影響收縮表型。我們推測(cè)，RV感染可能導(dǎo)致EMMPRIN上調(diào)，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化，促進(jìn)氣道炎癥和重塑。本研究調(diào)查poly(I:C)刺激的上皮細(xì)胞對(duì)成纖維細(xì)胞增殖和α－SMA表達(dá)的影響，確定EMMPRIN在該過程的作用及信號(hào)通路。

材料和方法

1 材料

人肺泡上皮細(xì)胞株(A549)由中國科技大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供;胎牛血清(FCS，杭州四季青公司)、MEM(Hyclone)、EMMPRIN(R＆D)、poly(I:C)(Sigma);p38 MAPK選擇性阻斷劑SB203580和ERK1/2選擇性阻斷劑PD98059(Sigma)，磷酸化與非磷酸化p38 MAPK和ERK1/2抗體(Promega)，小鼠抗人α－SMA單克隆抗體(Novocastra)，EMMPRIN ELISA試劑盒(R＆D)。

2 方法

2.1 氣道上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基(conditioned medium，CM)制備 A549細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后以每孔2×106接種于6孔培養(yǎng)板，用含10%FCS的MEM培養(yǎng)至90%匯合，以含20 mg/L poly(I:C)的無血清MEM培養(yǎng)，24 h后收集CM，2 000 r/min離心5 min，過濾后用于下述實(shí)驗(yàn)。

2.2 人氣道成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng) 按作者既往方法［7］進(jìn)行貼塊培養(yǎng)，標(biāo)本源自弋磯山醫(yī)院肺癌病人。

2.3 A549－CM刺激成纖維細(xì)胞 將成纖維細(xì)胞接種于24孔板蓋玻片上(免疫組化)或6孔板(提取細(xì)胞蛋白)各孔中，待達(dá)到80% ～90%匯合時(shí)換無血清MEM培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分3組:MEM－成纖維細(xì)胞、正常A549－CM(以MEM 1∶1稀釋)－成纖維細(xì)胞和poly(I:C)－A549－CM(1∶1稀釋，下同)－成纖維細(xì)胞;在另一些孔中預(yù)先1 h加入SB203580(5或10 μmol/L)或 PD98059(5 或10 μmol/L)后以 poly(I:C)－A549－CM培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h、24 h或48 h檢測(cè)細(xì)胞增殖或α－SMA表達(dá)，部分培養(yǎng)0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h提蛋白檢測(cè)磷酸化與非磷酸化 p38 MAPK和ERK1/2水平，選擇12 h、24 h及48 h的成纖維細(xì)胞上清－80℃凍存待測(cè)EMMPRIN，48 h上清用于MMP－2、－9酶譜分析。

2.4 EMMPRIN刺激成纖維細(xì)胞 用與2.3相似的方法培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，分別給予MEM和EMMPRIN(5 mg/L或10 mg/L)刺激12 h或48 h，檢測(cè)細(xì)胞增殖和α－SMA表達(dá)，48 h取上清進(jìn)行 MMP－2和MMP－9酶譜分析。

2.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 以BrdU細(xì)胞摻入測(cè)定成纖維細(xì)胞增殖，將成纖維細(xì)胞以每孔5×104接種于24孔板中蓋玻片，至80%匯合時(shí)無血清MEM培養(yǎng)24 h;分別以MEM或正常A549－CM或poly(I:C)－A549－CM培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，每種培養(yǎng)均設(shè)立3復(fù)孔平行實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)16 h后加入BrdU(100 mmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)8 h后固定細(xì)胞進(jìn)行BrdU免疫組化實(shí)驗(yàn)。

2.6 α－SMA免疫熒光與 Western blotting檢測(cè)4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min(室溫)，0.05%Triton X－100穿透細(xì)胞10 min，α－SMA抗體1∶50。依次加FITC－標(biāo)記的羊抗鼠Ⅱ抗、Alex 594 phalloidin(1∶1 000)和 DAPI(500 μg/L，95% 乙醇稀釋)后，80%甘油封片。熒光顯微鏡下觀察α－SMA(綠色)，截圖保存。Western blotting檢測(cè):PBS漂洗細(xì)胞2次，加100 μL 1×SDS裂解液，刮下細(xì)胞至EP管，冰上孵育10 min，95℃煮沸3～5 min，14 000 r/min離心10 min，BSA法測(cè)濃度。取50 μg蛋白 SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，脫脂奶室溫封閉1 h，Ⅰ抗4℃孵育過夜，Ⅱ抗室溫1 h，ECL發(fā)光顯色。ImageJ軟件進(jìn)行圖像處理，測(cè)定灰度值。

2.7 p38 MAPK和ERK1/2的Western blotting檢測(cè)采用與2.6相似的方法。利用ImageJ軟件進(jìn)行分析，以非磷酸化條帶為內(nèi)參照，計(jì)算磷酸化與相應(yīng)非磷酸化條帶灰度的相對(duì)比值。

2.8 成纖維細(xì)胞凝膠收縮實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)制備成

纖維細(xì)胞－膠原混懸液(0.75 g/L膠原，1×108/L成纖維細(xì)胞，1×MEM，pH 7.4)，并立即將該混懸液移入24孔培養(yǎng)板中(每孔加600 μL)，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)20～30 min，待混懸液形成凝膠時(shí)每孔加入400 μL含10%FCS的MEM繼續(xù)培養(yǎng)，次日無血清MEM培養(yǎng)24 h，用加樣槍槍頭尖端沿凝膠邊緣輕輕分離凝膠。實(shí)驗(yàn)分3組:MEM－成纖維細(xì)胞、正常A549－CM－成纖維細(xì)胞和poly(I:C)－A549－CM－成纖維細(xì)胞，每組3孔，培養(yǎng)48 h后取出凝膠并拍照。以凝膠直徑縮小的程度表示凝膠收縮能力的強(qiáng)弱。同樣實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，比較各組凝膠直徑與無細(xì)胞情況下凝膠直徑的差異，計(jì)算收縮的百分比。

2.9 MMP－2和MMP－9酶譜分析 收集成纖維細(xì)胞上清，冷凍離心去除細(xì)胞碎片。取5 μL樣本進(jìn)行含0.1%明膠的 SDS－PAGE非變性凝膠電泳，2.5%Triton X－100室溫輕搖漂洗30 min去除SDS，37℃孵育過夜，考馬斯藍(lán)染色后脫色。對(duì)脫色后條帶拍照并用ImageJ軟件進(jìn)行分析，以正常成纖維細(xì)胞上清MMP－2和MMP－9為內(nèi)參照，計(jì)算A549－CM－成纖維細(xì)胞和poly(I:C)－A549－CM－成纖維細(xì)胞上清MMP－2和MMP－9條帶灰度的相對(duì)比值。

3.0 EMMPRIN濃度測(cè)定 采用ELISA法檢測(cè)成纖維細(xì)胞上清 EMMPRIN水平，操作按說明進(jìn)行。EMMPRIN最低測(cè)定限值為1.35 ng/L。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 poly(I:C)－上皮細(xì)胞上清誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖

由圖1可見，poly(I:C)－上皮細(xì)胞上清誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖，12 h最明顯，其后刺激作用漸減弱;正常上皮細(xì)胞上清也刺激成纖維細(xì)胞增殖，但無poly(I:C)－上皮細(xì)胞上清作用明顯。BrdU摻入率的結(jié)果顯示:poly(I:C)－上皮細(xì)胞上清刺激的成纖維細(xì)胞12 h增殖率顯著高于MEM或正常上皮細(xì)胞上清刺激的成纖維細(xì)胞(P＜0.01)，而24 h和48 h增殖率雖明顯高于MEM培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞(P＜0.05)，但與正常上皮細(xì)胞上清刺激的成纖維細(xì)胞無顯著差異;相對(duì)于MEM，正常上皮細(xì)胞上清也明顯刺激成纖維細(xì)胞增殖，24 h最顯著(P ＜0.01)，見表1。

Figure 1.Effect of A549 cell supernatants on the proliferation of human bronchial fibroblasts(HBFs).HBFs growing in 24－well plates were cultured under FCS－free condition with MEM(1)，normal A549－CM(2)or poly(I:C)－A549－CM(3)for 12，24 or 48 h.Cell proliferation was assessed with the BrdU DNA －incorporation assay.圖1 A549細(xì)胞上清對(duì)人氣道成纖維細(xì)胞增殖的影響

2 Poly(I:C)－上皮細(xì)胞上清誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞α－SMA表達(dá)和凝膠收縮

表1 A549細(xì)胞上清對(duì)氣道成纖維細(xì)胞增殖率的影響Table 1.Effect of A549 cell supernatants on airway fibroblast proliferation rate(%.ˉx±s.n=3)

免疫熒光、Western blotting及凝膠收縮實(shí)驗(yàn)顯示，poly(I:C)－上皮細(xì)胞上清增加成纖維細(xì)胞α－SMA表達(dá)和凝膠收縮，48 h最顯著;正常上皮細(xì)胞上清輕度刺激成纖維細(xì)胞α－SMA表達(dá)和凝膠收縮，但不及poly(I:C)－上皮細(xì)胞上清刺激作用明顯，見圖2。

Figure 2.Effects of A549 cell supernatants on α － SMA expression(A:immunofluorescence;B:Western blotting)in HBFs and contraction of HBF－populated collagen gels(C).HBFs were cultured with MEM(1)，normal A549－CM(2)or poly(I:C)－A549－CM(3)for 12，24 or 48 h.ˉx±s.n=3.*P＜0.05 vs 1;#P＜0.05 vs 2.圖2 A549細(xì)胞上清對(duì)人氣道成纖維細(xì)胞α－SMA表達(dá)和凝膠收縮的影響

3 Poly(I:C)－上皮細(xì)胞上清誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞EMMPRIN表達(dá)

見圖3A;同時(shí)α－SMA表達(dá)增加，并且EMMPRIN濃度越高刺激作用更明顯，見圖3B。

Poly(I:C)－上皮細(xì)胞上清刺激成纖維細(xì)胞后，其培養(yǎng)上清中EMMPRIN含量明顯高于另2組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)(P＜0.05)，正常上皮細(xì)胞上清刺激的成纖維細(xì)胞上清中EMMPRIN含量較MEM組雖增加，但差異均不顯著(P＞0.05)，見表2。

4 EMMPRIN誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖和α－SMA表達(dá)

表2 A549細(xì)胞上清對(duì)成纖維細(xì)胞EMMPRIN表達(dá)的影響Table 2.Effects of A549 cells supernatants on airway fibroblasts EMMPRIN expression(ng/L.ˉx±s.n=3)

成纖維細(xì)胞給予EMMPRIN刺激后，增殖增強(qiáng)，

Figure 3.Effects of EMMPRIN on proliferation(A)of HBFs and α － SMA expression(B)in HBFs.HBFs growing in 24 － well plates were cultured under FCS－free condition with MEM(1)，5 mg/L EMMPRIN(2)or 10 mg/L EMMPRIN(3)for 12 h(A)or 48 h(B).ˉx±s.n=3.*P＜0.05 vs 1 or 2.圖3 EMMPRIN對(duì)人氣道成纖維細(xì)胞增殖和α－SMA表達(dá)的影響

5 EMMPRIN為poly(I:C)－上皮細(xì)胞上清誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞MMP－2和MMP－9生成的重要成分

酶譜分析MMP－2和MMP－9活性顯示:相對(duì)于MEM或正常A549－CM刺激的成纖維細(xì)胞上清，MMP－2和MMP－9活性在poly(I:C)－A549－CM刺激的成纖維細(xì)胞上清中升高，見圖4;以EMMPRIN刺激成纖維細(xì)胞，其上清中MMP－2和MMP－9活性相應(yīng)升高，并且濃度越高刺激作用越明顯，見圖5。

6 Poly(I:C)－上皮細(xì)胞上清誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞p38 MAPK和ERK1/2信號(hào)通路活化，后兩者參與α－SMA和EMMPRIN表達(dá)

Western blotting結(jié)果表明，poly(I:C)－上皮細(xì)胞上清刺激成纖維細(xì)胞1 h后，p－p38 MAPK蛋白出現(xiàn)，2～4 h最明顯，其后減弱;p－ERK1/2蛋白在刺激1 h后達(dá)高峰，持續(xù)至4 h后減弱，見圖6A。p38 MAPK或ERK1/2抑制劑抑制相應(yīng)蛋白表達(dá)，同時(shí)減弱α－SMA表達(dá)，見圖6B。p38 MAPK和ERK1/2抑制劑均明顯減弱poly(I:C)－A549－CM誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞EMMPRIN表達(dá)，SB203580呈濃度依賴性，而5 μmol/L 和 10 μmol/L PD98059 的抑制作用無顯著差異，見表3。

討 論

成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞是哮喘氣道重塑的一個(gè)重要方面，我們過去實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)損傷的氣道上皮細(xì)胞誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞［7］，在本實(shí)驗(yàn)中，我們以RV dsRNA模擬合成物poly(I:C)作用的上皮細(xì)胞上清刺激成纖維細(xì)胞，間接了解RV感染氣道上皮細(xì)胞后對(duì)成纖維細(xì)胞活化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)poly(I:C)作用的上皮細(xì)胞上清時(shí)間依賴性誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖并增強(qiáng)α－SMA表達(dá)，提示RV感染支氣管上皮細(xì)胞后誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖促進(jìn)氣道壁纖維化，而收縮蛋白的表達(dá)增強(qiáng)氣道反應(yīng)性。

Figure 4.Effects of poly(I:C)－A549 cell supernatants on MMP－2 and MMP－9 activity in HBFs.HBFs growing in 24－well plates were cultured under FCS－free condition with MEM(1)，normal A549－CM(2)or poly(I:C)－A549－CM(3)for 48 h.MMP－2 and MMP－9 activity in supernatants from HBFs was assessed with zymography.ˉx±s.n=3.*P＜0.05 vs 1 or 2.圖4 Poly(I:C)－A549細(xì)胞上清對(duì)成纖維細(xì)胞MMP－2和MMP－9活性的影響

Figure 5.Effects of EMMPRIN on MMP－2 and MMP－9 activity in HBFs.HBFs growing in 24－well plates were cultured under FCS－free condition with MEM(1)，5 mg/L EMMPRIN(2)or 10 mg/L EMMPRIN(3)for 48 h.MMP－2 and MMP－9 activity in supernatants from HBFs was assessed with zymography.ˉx±s.n=3.*P ＜0.05 vs 1.圖5EMMPRIN對(duì)成纖維細(xì)胞MMP－2和MMP－9活性的影響

EMMPRIN是一個(gè)58 kD跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白(Ig)超家族，EMMPRIN可從細(xì)胞表面脫落，作為一種彌散因子作用于鄰近細(xì)胞，或作為轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)β下游介質(zhì)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化。已報(bào)道［8］EMMPRIN可誘導(dǎo)α－SMA表達(dá)參與肌成纖維細(xì)胞分化和膠原基質(zhì)收縮。本研究觀察到poly(I:C)作用的上皮細(xì)胞上清增強(qiáng)成纖維細(xì)胞上清中EMMPRIN水平，后者劑量依賴性進(jìn)一步誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖和α－SMA表達(dá)，提示EMMPRIN是RV感染誘導(dǎo)氣道重塑過程中成纖維細(xì)胞活化的一種重要中間媒介。

EMMPRIN的直接功能是誘導(dǎo)多種MMPs生成，人重組EMMPRIN刺激成纖維細(xì)胞MMP－1、MMP－2和MMP－3生成和激活，呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷大鼠肺組織MMP－2增多前EMMPRIN mRNA表達(dá)增加，這些MMPs在ECM降解及組織中性粒細(xì)胞浸潤發(fā)揮關(guān)鍵作用，還與組織重塑有密切關(guān)系。有關(guān)研究認(rèn)為支氣管成纖維細(xì)胞MMP－2活性與哮喘病人FEV1%預(yù)測(cè)值負(fù)相關(guān)，而與氣道高反應(yīng)性呈正相關(guān);MMP－9與氣道炎癥和重塑的相關(guān)性體現(xiàn)在MMP－9缺陷的小鼠哮喘模型支氣管壁纖維化減輕并且肺總膠原蛋白減少，MMP－9抑制劑延緩過敏性氣道炎癥的發(fā)展。此外，研究也表明MMPs可促進(jìn)成纖維細(xì)胞收縮反應(yīng)，表達(dá)α－SMA的肌成纖維細(xì)胞同時(shí)表達(dá)高水平的MMPs如MMP－2［8］。鑒于過敏性哮喘患者支氣管肺泡灌洗液、血、痰MMP－2和MMP－9水平顯著升高，同時(shí)人鼻病毒－16感染增加支氣管上皮細(xì)胞MMP－9表達(dá)，我們檢測(cè)了poly(I:C)－上皮細(xì)胞上清對(duì)成纖維細(xì)胞MMP－2、－9生成的誘導(dǎo)作用，poly(I:C)作用的上皮細(xì)胞上清增強(qiáng)成纖維細(xì)胞上清中MMP－2、MMP－9活性，并且EMMPRIN濃度依賴性激活成纖維細(xì)胞MMP－2、MMP－9活性，這提示EMMPRIN誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞MMP－2、－9激活在RV觸發(fā)氣道重塑過程中具有重要作用。

Figure 6.Effects of poly(I:C)－A549 cell supernatants on p38 MAPK and ERK 1/2 phosphorylation and roles of p38 MAPK and ERK1/2 signaling pathways in α － SMA expression in HBFs.A:HBFs were incubat for the indicated time with poly(I:C)－A549－CM，after which cell lysates were prepared and subject to immunoblotting analysis with antibodies to p38 MAPK，ERK1/2，or their phosphorylated forms.B:HBFs pre － added with SB203580 or PD98059 for 1 h were cultured with poly(I:C)－A549 －CM for 1 h(for p38 MAPK and ERK1/2)or 48 h(for α －SMA).p38 MAPK，ERK1/2 and α －SMA expression were measured by Western blotting.1:poly(I:C)－A549－CM;2:poly(I:C)－A549－CM+5 μmol/L SB203580;3:poly(I:C)－A549－CM+10 μmol/L SB203580;4:poly(I:C)－A549－CM;5:poly(I:C)－A549－CM+5 μmol/L PD98059;6:poly(I:C)－A549－CM+10 μmol/L PD98059.ˉx±s.n=3.*P＜0.05 vs 0 h;#P＜0.05 vs 3 or 6;☆P＜0.05 vs 2 or 5.圖6 A549細(xì)胞上清對(duì)人氣道成纖維細(xì)胞p38 MAPK和ERK1/2信號(hào)活化的影響及p38 MAPK和ERK1/2在α－SMA表達(dá)的作用

表3 Poly(I:C)－A549上清對(duì)成纖維細(xì)胞24 h EMMPRIN表達(dá)的影響及SB203580、PD98059的作用Table 3.Effects of poly(I:C)－A549 cell supernatants on EMMPRIN in HBFs at 24 h and the roles of SB203580 and PD98059(ng/L.ˉx±s.n=3)

研究表明絲裂原活化蛋白激酶家族的2種關(guān)鍵信號(hào):p38 MAPK調(diào)控許多細(xì)胞過程包括應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞分化、增殖、炎癥、血管發(fā)生和細(xì)胞因子生成，還調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞α－SMA表達(dá)，增強(qiáng)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的氣道收縮反應(yīng)［9］;ERK1/2參與成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成，亦能誘導(dǎo)細(xì)胞α－SMA表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)表明，RV誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞ERK 1/2信號(hào)激活是MMP－9表達(dá)上調(diào)的關(guān)鍵信號(hào)［10］。p38 MAPK和ERK1/2也是人肺成纖維細(xì)胞α－SMA表達(dá)的關(guān)鍵信號(hào)分子［9］，我們?cè)l(fā)現(xiàn)p38 MAPK與ERK1/2是損傷氣道上皮細(xì)胞誘導(dǎo)上皮下成纖維細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的重要信號(hào)［7］。Poly(I:C)可激活成纖維細(xì)胞p38 MAPK和 ERK1/2信號(hào)通路［11］，介導(dǎo)poly(I:C)誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞炎癥因子、趨化因子和黏附分子合成。既往研究發(fā)現(xiàn)EMMPRIN表達(dá)上調(diào)過程中p38 MAPK和ERK1/2激活［12］，提示 p38 MAPK和 ERK1/2通路參與 EMMPRIN的表達(dá)。本研究中我們觀察到poly(I:C)作用的上皮細(xì)胞上清時(shí)間依賴性誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞p38 MAPK和ERK1/2磷酸化，刺激60 min后兩者磷酸化水平均增加并持續(xù)激活，兩者特異性抑制劑有效減弱α－SMA表達(dá);此外，p38 MAPK和ERK1/2抑制劑減弱poly(I:C)作用的上皮細(xì)胞上清誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞EMMPRIN表達(dá)，說明這2種信號(hào)參與了poly(I:C)作用的上皮細(xì)胞誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞EMMPRIN表達(dá)過程。

總之，本研究表明，poly(I:C)作用的上皮細(xì)胞可能通過某些介質(zhì)如 EMMPRIN－MMPs，經(jīng)由 p38 MAPK和ERK1/2信號(hào)通路誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖或肌成纖維細(xì)胞分化，進(jìn)一步表明RV感染在哮喘急性發(fā)作期氣道反應(yīng)性升高發(fā)生機(jī)制中的重要地位，阻斷p38 MAPK和ERK1/2通路調(diào)節(jié)EMMPRIN表達(dá)可能對(duì)病毒感染誘發(fā)的氣道重塑具有有益的治療價(jià)值。

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