符路娣

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，廣東廣州 510405）

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis,OA）是我國四大老年病之一，是一種嚴重影響病人生活質(zhì)量和社會生產(chǎn)力的慢性進行性骨關(guān)節(jié)病。該病不僅發(fā)生關(guān)節(jié)軟骨損傷，還累及整個關(guān)節(jié)，包括關(guān)節(jié)軟骨下骨、韌帶、關(guān)節(jié)囊、滑膜和關(guān)節(jié)周圍肌肉，最終發(fā)生關(guān)節(jié)軟骨退變，纖維化，斷裂潰瘍及整個關(guān)節(jié)面的損害[1]。近年來，隨著對OA 發(fā)病機制研究的深入，認識到在OA 的病理過程中白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) 是促進軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨破壞的致炎因子。目前對OA 的治療方法頗多但效果不夠理想。本實驗應(yīng)用家兔OA 模型進行研究，觀察比較臭氧和藥物治療的效果。現(xiàn)將實驗報告如下。

1 材料與方法

1.1 OA 模型制備及分組

新西蘭兔80只，體重2.2-2.5kg，雌雄各半，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（粵）2008-0020。隨機抽取10只作為正常對照組（簡稱A組），正常組不做任何處理，正常喂養(yǎng)。其余70只，分別于實驗的第1 天、第4天于右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射Ⅱ型膠原蛋白酶溶液0.5ml 制備骨性關(guān)節(jié)炎動物模型，造模成功后隨機分為模型對照組(簡稱B組)和治療組，治療組又分為:10ug/ml 臭氧關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療組（簡稱C10組）,20ug/ml 臭氧關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療組（簡稱C20組）；40ug/ml 臭氧關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療組（簡稱C40組）；低劑量活血止痛膠囊灌胃治療組（簡稱D低組）,中劑量活血止痛膠囊灌胃治療組（簡稱D中組）；高劑量活血止痛膠囊灌胃治療組（簡稱D高組），每組10只。

1.2 方法

1.2.1 造模方法

（1）II 型膠原蛋白酶的配制：將II 型膠原蛋白酶按2mg/0.5ml 的濃度溶解于生理鹽水中，用0.2um 的無菌試管濾器過濾后裝入50ml 無菌瓶中，并置于0℃以下冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）蛋白酶溶液的注射：將新西蘭兔固定于固定架上，剪去膝關(guān)節(jié)處的兔毛，75%酒精消毒后用左手從下方和兩旁將關(guān)節(jié)固定，在髕韌帶附著點外上方約0.5cm 處進針。針頭從上前方向下后方傾斜刺入，直至針頭遇阻力變小為止，然后針頭稍后退，以垂直方向推入，當(dāng)出現(xiàn)落空感時，表明已進入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，即可注入藥液。

1.2.2 細胞因子檢測

A.經(jīng)耳中動脈抽取5ml 血液，4000 轉(zhuǎn)離心10 min，分離血清約600μl，保存于-80℃冰箱備檢。

B.雙抗體ELISA 法測定IL-1β、TNF-α 的含量。根據(jù)血清樣品的吸光度值,通過擬合后的公式計算出其濃度。

1.3 實驗設(shè)備與藥物

A.實驗設(shè)備：意大利ECO3 di Franco Sardi 公司生產(chǎn)的Ozonline-E80 型醫(yī)用臭氧發(fā)生器；

B.藥物：活血止痛膠囊（中藥制劑，主要組成：當(dāng)歸、三七、土鱉蟲等）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以SPSS 軟件進行統(tǒng)計分析，并以均數(shù)上標(biāo)準(zhǔn)差表示結(jié)果。

2 結(jié)果

各實驗組血清TNF-α和IL-1β 活性的測量結(jié)果詳見下表。

由表可見，B、C、D組與A組比較有顯著性差異（p＜0.05）,這說明造模成功；C組與B組比較沒有顯著性差異（p＞0.05）,這說明臭氧無抑制已升高的血清TNF-α和IL-1β含量的作用；D組與B組比較有顯著性差異（p＜0.05），這說明藥物灌胃治療均能抑制已升高的血清TNF-α和IL-1β含量的作用。

表各組血清TNF-α和IL-1β 濃度

3 討論

3.1 IL-1β 在OA 病程中的作用

在骨性關(guān)節(jié)炎病理進程中,關(guān)節(jié)軟骨和滑膜的病理變化是由一系列細胞因子的變化引起的。其中備受關(guān)注的細胞因子是IL-1β和TNF-α，經(jīng)研究證實，這兩種細胞因子是OA 病理變化過程中加速軟骨基質(zhì)降解和促使關(guān)節(jié)軟骨退變的最重要的兩種細胞因子[2]，是炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑。1983年Wood等首先報道了在骨性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)液中檢測到了高水平的IL-1，提出IL-1 可能直接參與了骨關(guān)節(jié)炎的病理增生過程。在隨后的研究中，有更多學(xué)者證實了Wood的觀點，并進一步證實細胞因子的活性與關(guān)節(jié)軟骨的破壞嚴重程度呈正相關(guān)。IL-1 為17KDb 的細胞因子，主要由單核-巨噬細胞產(chǎn)生，也能由中性粒細胞合成，分為膜結(jié)合型（IL-1α）和可溶型（IL-1β）兩種。IL-1 多存在于血液和組織中，它在OA 中主要參與刺激前列腺炎等介質(zhì)釋放，上調(diào)內(nèi)皮細胞粘附分子受體表達，以及促進膠原酶和其他中性蛋白酶合成，從而增強滑膜和滑液內(nèi)炎癥反應(yīng)，促進滑膜細胞增生正常狀態(tài)下保持平衡；失衡時，產(chǎn)生免疫病理反應(yīng)[3-6]。有研究證明IL-1是炎癥調(diào)節(jié)的始動因素，與受體（IL-1RI）結(jié)合后形成復(fù)合物，繼而發(fā)生一系列的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致NO、PGE2、IL-6、IL-8以及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)水平增高，從而介導(dǎo)軟骨細胞凋亡，合成II型膠原和蛋白多糖的能力損害，以及軟骨基質(zhì)降解[7-8]。

3.2 TNF-α 在OA 病程中的作用

TNF-α 是體內(nèi)炎癥細胞分泌的一種細胞因子，是復(fù)合體，具有多種生物學(xué)活性。在骨性關(guān)節(jié)炎滑液中TNF-α 是最早出現(xiàn)的細胞因子，而且影響關(guān)節(jié)軟骨的降解過程[9]。TNF-α 可通過直接與破骨細胞前體上的TNFR-1 結(jié)合，進而誘導(dǎo)破骨細胞的成熟，或者使間充質(zhì)細胞上的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）表達增加，進一步誘導(dǎo)破骨細胞發(fā)育成熟或破骨細胞功能增強，導(dǎo)致骨質(zhì)吸收和骨質(zhì)破壞[10]。

本實驗中檢測到OA 模型中的血清IL-1β和TNF-α含量都升高,與其他研究結(jié)果一致,采用臭氧進行局部治療的血清IL-1β和TNF-α含量的變化無統(tǒng)計學(xué)意義,這也說明臭氧的局部應(yīng)用并沒有對這兩種細胞因子的產(chǎn)生起到抑制或降低其含量的作用。臭氧對骨關(guān)節(jié)炎的作用機制,仍需進行更多的實驗研究進一步證實。

活血止痛膠囊治療的血清IL-1β和TNF-α含量的變化有統(tǒng)計學(xué)意義,這可能是活血止痛膠囊通過降低骨關(guān)節(jié)液中IL-1β和TNF-α 的含量,從而降低關(guān)節(jié)的局部炎癥反應(yīng)、消腫鎮(zhèn)痛等作用。這些可能與藥物中當(dāng)歸、三七、土鱉蟲等成分具有抗炎、止痛作用有關(guān)。

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