呂學(xué)高，樓肖成，朱正梅，趙軍華

(浙江省東陽(yáng)玉米研究所，浙江 東陽(yáng) 322105)

SSR (simple sequence repeats)標(biāo)記因具有快速、準(zhǔn)確，信息含量高、呈共顯性分離、易于分析、重復(fù)可靠等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于玉米指紋圖譜構(gòu)建、品種真實(shí)性鑒定以及純度檢驗(yàn)［1-3］。利用SSR指紋技術(shù)鑒定區(qū)域試驗(yàn)品種的一致性和真實(shí)性在普通玉米中已于2002年開展，并出臺(tái)了相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，2006年在鮮食甜、糯玉米上也開展了此項(xiàng)工作［4］。作者以浙江省4個(gè)甜玉米和3個(gè)糯玉米品種為材料，選用38 對(duì)玉米SSR 核心引物分析檢測(cè)純度，以期為浙江特用玉米新品種保護(hù)和種子生產(chǎn)提供參考，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、糧食安全和農(nóng)民利益提供幫助?，F(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

7個(gè)特用玉米品種，4個(gè)甜玉米是超甜3號(hào)(三交種)、超甜4號(hào)、浙甜6號(hào)、浙甜8號(hào);3個(gè)糯玉米分別是浙糯玉1號(hào) (三交種)、浙糯玉3號(hào)、浙糯玉4號(hào)。38 對(duì)引物參照北京農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心核心引物篩選［2，5］(表1)，由上海生工生物工程(上海)有限公司合成。SSR 標(biāo)記在浙江省農(nóng)科院作物與核技術(shù)應(yīng)用研究所分子育種中心檢測(cè)。

1.2 方法

玉米基因組DNA 提取。隨機(jī)選取超甜3號(hào)和浙糯玉1號(hào)玉米種子15粒，其余品種10粒，將玉米種子置于20 (夜12 h)～26℃ (晝12 h)培養(yǎng)箱培養(yǎng)至2 葉1 心，取第2 葉片放入1.5 mL 離心管研磨，采用CTAB 法提取玉米總DNA。

SSR 檢測(cè)。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系10 μL，反應(yīng)體系組成:1 μL 10×Buffer、0.6 μL 25 mmol MgCl2、0.8 μL dNTP (各2.5 mmol)、0.05 μL Taq 酶(5 U·μL-1)、2 μL DNA 模板、2 μL SSR 引物、ddH2O 定容。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s，55～60℃退火40～60 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min［2，5］。

電泳檢測(cè):3%瓊脂糖凝膠 (0.5× TBE+EB)電泳，10 μL PCR 產(chǎn)物點(diǎn)樣，恒壓300 V，電泳30～60 min，AlphaImager EP 凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性引物篩選

38 對(duì)SSR 引物在7個(gè)品種中共篩選出具有多態(tài)性差異引物23對(duì)，其中 umc1125y3、bnlg1520K1、phi233376y1、phi041y6 在4個(gè)以上品種中均表現(xiàn)多態(tài)性差異，差異多態(tài)性頻率較高。umc2007y4、bnlg1702k1、umc1545y2、bnlg1671y17、umc1429y7 可作為超甜 3號(hào)品種純度檢測(cè);umc1125y3、umc1506k12、umc2115k3 可作為超甜4號(hào)品種純度檢測(cè);umc1125y3、umc2115k3、phi233376y1 可作為浙甜 6號(hào)品種純度檢測(cè);umc1125y3、bnlg240k1、phi080k15、umc2115k3、phi299852y2、phi041y6 可作為浙甜8號(hào)品種純度檢 測(cè);umc1125y3、umc1999y3、phi233376y1、umc2163w3 可作為浙糯玉1號(hào)品種純度檢測(cè);umc1125y3、umc1429y7 可作為浙糯玉3號(hào)品種純度 檢 測(cè);bnlg1702k1、umc1999y3、umc1429y7、phi299852y2、umc2160k3、phi233376y1、phi041y6可作為浙糯玉4號(hào)品種純度檢測(cè)。

表1 雜交種純度分析的引物

2.2 雜交種純度檢測(cè)

由表2 可以看出，7個(gè)特用玉米品種超甜3號(hào)、超甜4號(hào)、浙甜6號(hào)、浙甜8號(hào)、浙糯玉1號(hào)、浙糯玉3號(hào)、浙糯玉4號(hào)的SSR 平均檢測(cè)純度分別為87%，96.8%，96.5%，98.9%，89.3%，95.8%和99.0%。其中超甜3號(hào)和浙糯玉1號(hào)為三交種，單個(gè)引物位點(diǎn)檢測(cè)純度最低值分別為78.6% 和66.7%。由于SSR 檢測(cè)缺乏三親本完全差異位點(diǎn)，對(duì)無(wú)差異位點(diǎn)是否來(lái)自雙親遺傳難以判定，可能降低該位點(diǎn)檢測(cè)純度。

表2 雜交種純度的檢測(cè)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

選用的38 對(duì)玉米SSR 引物對(duì)7個(gè)特用玉米品種進(jìn)行純度檢測(cè)結(jié)果，共篩選差異性引物23 對(duì)，其 中，umc1125y3、bnlg1520K1、phi233376y1、phi041y6 等引物在多個(gè)品種中表現(xiàn)多態(tài)性。經(jīng)SSR檢測(cè)7個(gè)特用玉米品種超甜3號(hào)、超甜4號(hào)、浙甜6號(hào)、浙甜8號(hào)、浙糯玉1號(hào)、浙糯玉3號(hào)、浙糯玉4號(hào)的純度分別為87.0%，96.8%，96.5%，98.9%，89.3%，95.8%和99.0%。

玉米SSR 標(biāo)記豐富的多態(tài)性和目前已開發(fā)出2 000 多對(duì)玉米SSR 引物數(shù)量，為玉米雜交種純度鑒定提供保障。影響雜交玉米種子純度，通常有多種綜合因素，利用一種SSR 引物可能不能區(qū)分開是什么原因引起的混雜，因此選取那些擴(kuò)增條帶位置各不相同的引物，將它們組合起來(lái)擴(kuò)增得到的特異分子標(biāo)記，可以大大提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度［6-8］。

SSR 標(biāo)記檢測(cè)方法是在DNA 分子水平上的檢測(cè)手段，SSR 多態(tài)性是與性狀連鎖的DNA 標(biāo)記，與性狀間有一定的遺傳距離，因而在繁殖過程中可能出現(xiàn)交換導(dǎo)致基因重組，從而造成檢測(cè)的誤差。表現(xiàn)在檢測(cè)結(jié)果上，分子鑒定獲得的雜交種純度一般低于常規(guī)方法。要解決這一問題，可通過大量樣本的檢測(cè)分析，求出校正純度值的回歸方程，計(jì)算出更準(zhǔn)確的純度值［3］。

目前國(guó)內(nèi)外玉米生產(chǎn)上普遍利用單交種，這類雜交種遺傳性狀穩(wěn)定，雜交優(yōu)勢(shì)強(qiáng)，增產(chǎn)顯著。三交種的整齊度不如單交種，制種技術(shù)及環(huán)節(jié)也比單交種復(fù)雜，但制種產(chǎn)量比單交種成倍提高，且在特用玉米上有改善品質(zhì)、提高抗性等優(yōu)勢(shì)，這類雜交種在國(guó)內(nèi)外仍有少量利用［9］。三交種是一個(gè)雜合程度較大的遺傳平衡群體，具有較復(fù)雜的遺傳基礎(chǔ)，目前SSR 分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于三交種測(cè)定的研究報(bào)道較少，如三個(gè)親本SSR 完全差異引物的大量篩選、基因交換重組比例、測(cè)定群體的擴(kuò)大等研究有待深入。

［1］邱紅波，戴保威，彭中華.利用SSR 標(biāo)記對(duì)貴州主要玉米種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，23(4):667-670.

［2］趙久然，王鳳格，郭景倫，等.中國(guó)玉米新品種DNA 指紋庫(kù)建立系列研究Ⅱ.適于玉米自交系和雜交種指紋圖譜繪制的SSR 核心引物的確定［J］.玉米科學(xué)，2003，11(2):3-5，8.

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