楊 曄， 李國輝， 高劍平， 丁重陽*， 顧正華， 張 梁， 石貴陽

（1.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；2.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 漳州363000）

木質(zhì)素降解酶主要有3種：木質(zhì)素過氧化物酶（Lignin peroxidases/Lip）、錳過氧化物酶（Manganese peroxidases/Mnp）和漆酶（Laccase/Lac），這些氧化酶對多種污染物都表現(xiàn)出了廣譜的降解作用，包括酚類、多環(huán)芳烴、多種染料、五氯聯(lián)苯等難降解物質(zhì)[1]，其中Lip與Mnp合成后分泌到胞外 ，經(jīng)H2O2啟動一系列自由基鏈反應(yīng) ，依靠氧化還原反應(yīng)降解各種結(jié)構(gòu)的染料[2]，具有重要的應(yīng)用價值。據(jù)報道，白腐真菌擁有強大的木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)[3]，但真菌的在極端環(huán)境和底層環(huán)境中，如高pH值，缺氧，高滲透壓以及木質(zhì)素濃聚物中的穩(wěn)定性較差；而細(xì)菌具有來源廣泛、生長快速，適應(yīng)能力強，易于改造及大規(guī)模應(yīng)用等優(yōu)勢，且在木質(zhì)素的降解過程中，需要多菌種協(xié)同作用[4]，因此細(xì)菌產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的研究顯示出誘人的前景和廣闊的發(fā)展空間。目前，對于細(xì)菌產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的研究，主要以木質(zhì)素過氧化物酶（Lip）為主[5-6]，鮮有關(guān)于細(xì)菌產(chǎn)錳過氧化物酶的研究報道。

作者從采自江蘇省無錫市多個木材廠的腐木及腐殖土的表層土樣等12份樣品中篩選得到一株高產(chǎn)錳過氧化物酶活力的菌株，并對其在孔雀石綠染料降解與脫色上的應(yīng)用進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

從無錫某木材廠中采集到的腐木及腐殖土的表層土樣等12份樣品。

1.2 培養(yǎng)基

無 機 培 養(yǎng) 基 （g/L）：K2HPO41；NaH2PO41，（NH4）2SO40.5；MgSO40.2；CaCl20.1；FeSO40.05；MnSO40.02；木屑 10；pH 值 7.0；LB 培養(yǎng)基（g/L）：氯化鈉5，酵母膏5，蛋白胨10，pH值自然；苯胺藍脫色培養(yǎng)基[7]：每1 000 mL LB培養(yǎng)基中加入0.1 g苯胺藍，避光；染料脫色培養(yǎng)基（g/L）：LB培基中加入一定量的染料構(gòu)成染料脫色培養(yǎng)基。

1.3 試劑及儀器

主要試劑：孔雀石綠；磷酸氫二鉀，磷酸二氫鈉，硫酸銨，硫酸鎂，氯化鈣，硫酸亞鐵，硫酸錳：分析純，均為國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

主要儀器：U-3000紫外分光光度計：日立公司產(chǎn)品；MK3酶標(biāo)儀：上?？茖W(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 產(chǎn)木質(zhì)素降解酶菌株篩選 稱取10 g腐殖土，加入含有90 mL無菌水的錐形瓶中，置于搖床150 r/min振蕩20 min，取10 mL上述溶液接種于無機培養(yǎng)基（50 mL/250 mL），30℃、150 r/min富集培養(yǎng)7 d后，取富集液適當(dāng)稀釋涂布苯胺藍脫色培養(yǎng)基，30℃避光培養(yǎng)，選取透明圈產(chǎn)生快速、明顯的菌落接種50 mL LB培養(yǎng)基，24 h后轉(zhuǎn)接相同新鮮LB培養(yǎng)基，30℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)。定時取樣測定酶活力，選取產(chǎn)酶活力高的菌株經(jīng)多次復(fù)篩純化后保藏待用。

1.4.2 酶活力的測定 Mnp酶活力的測定按文獻[8]的方法進行，Lip酶活力的測定按文獻[9]提供的方法進行，按文獻[10]提供的方法進行Lac酶活力的測定。

1.4.3 菌 種 鑒 定 參 照 《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology （Vol.Ⅳ ）》對菌株 J09 進行生理生化鑒定。通過Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction和DNA自動測序儀 （美國Applied Biosystems公司，型號 ABI 3130）測定 16S rDNA序列，并通過16S rDNA進行同源性序列比較及進化樹分析對菌株J09進行菌種鑒定。

1.4.4 菌種對染料的脫色 染料最大吸收波長的測定：使用分光光度計對含一定量染料的空白發(fā)酵液在200～900 nm進行全波長掃描，確定其最大吸收波長。

發(fā)酵液對染料的脫色：培養(yǎng)至酶活力最高時加入一定濃度染料，30℃，150 r/min繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3 h取樣，離心取上清液，在最大吸收波長下檢測染料吸光值的變化。

粗酶液對染料的脫色：培養(yǎng)至酶活力最高時，離心除去菌體，得粗酶液，100 mL錐形瓶中加50 mL粗酶液和一定濃度的染料，定時取樣，檢測染料吸光值的變化，至吸光值不變。

生物量的測定：測定所取培養(yǎng)基樣品在620 nm下的吸光度，以不接菌的空白培養(yǎng)基為對照；脫色率的測定：加入染料后混勻，在染料的最大吸收波長下測定上清液初始吸光值A(chǔ)0，定時取樣，測定上清液吸光值 A1。 染料脫色率=（（A0-A1）/A0）×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)錳過氧化物酶細(xì)菌的篩選

初篩獲得具有產(chǎn)錳過氧化物酶能力的菌株70株，在進一步復(fù)篩獲得6株菌株的基礎(chǔ)上篩選得到1株具有高產(chǎn)錳過氧化物酶能力的菌株J09。在優(yōu)化的條件下，該菌株發(fā)酵3 d錳過氧化物酶活力達到最大，為607.7 U/L。

2.2 產(chǎn)錳過氧化物酶細(xì)菌的鑒定

參 照 《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology（Vol.Ⅳ ）》對菌株J09進行生理生化鑒定。生理生化特征與草木犀中華根瘤菌相吻合，結(jié)果見表1。

表1 菌株J09的生理生化特征Tab.1 Conventional tests for identification of J09

利用PCR技術(shù)和DNA測序技術(shù)對得到的菌株進行16S rDNA擴增測序，將測序結(jié)果與GeneBank中已知的16S rDNA序列進行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最終確定菌株的進化分類地位。結(jié)果如圖1顯示，菌株J09與草木犀中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）同源性達到99%，命名為草木樨中華根瘤菌J09（Sinorhizobium meliloti J09）。該菌株已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC M 2011318。

圖1 基于16s RNA序列同源性的J09系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of J09 based on 16s RNA sequences

2.3 Sinorhizobium meliloti J09對染料的脫色

2.3.1 脫色光譜分析 在LB培養(yǎng)基中添加孔雀石綠至終質(zhì)量濃度為15 mg/L，由圖2可見，孔雀石綠的最大吸收波長在617 nm。經(jīng)過發(fā)酵液和粗酶液脫色后，此處的吸收峰均明顯降低，且經(jīng)發(fā)酵液脫色后的吸光值降低幅度較大，表明該菌株所產(chǎn)酶對孔雀石綠有明顯的脫色作用，且其菌體對孔雀石綠也具有一定的吸附作用。

圖2 孔雀石綠及脫色處理后的紫外—可見光譜Fig.2 Visible spectrumof malachite green

圖3 孔雀石綠脫色率隨時間變化曲線Fig.3 Decolorization rate of malachite green at different times

2.3.2 發(fā)酵液及粗酶液對孔雀石綠染料的脫色由圖3可知，發(fā)酵液與粗酶液對孔雀石綠均表現(xiàn)出顯著的脫色效果。脫色處理3 h時，發(fā)酵培養(yǎng)液對染料的脫色率已經(jīng)達到89.8%，粗酶液對染料的脫色率達到78.5%；3 h后，隨時間的延長，脫色率增長緩慢，推測其原因為菌體對染料的吸附能力已基本飽和且粗酶液酶活降低。

在Mnp酶活為607.7 U/L的粗酶液中加入孔雀石綠后并沒有立即表現(xiàn)出脫色效果，而含有菌體的發(fā)酵液在加入孔雀石綠后，隨即表現(xiàn)出42%的脫色率，表明菌體細(xì)胞對孔雀石綠有一定的吸附作用。發(fā)酵液的脫色效果是菌體吸附與酶降解共同作用的結(jié)果，因而優(yōu)于粗酶液，這與光譜分析的結(jié)果一致。

2.3.3 氧氣對培養(yǎng)液脫色效果的影響 由圖4可見，在振蕩培養(yǎng)的條件下的脫色率均高于靜置培養(yǎng)條件下的脫色率，表明該菌在氧氣充足的條件下脫色效果更好。草木犀中華根瘤菌是好氧細(xì)菌，充足的溶氧更利于菌體生長和酶的合成，因此對染料有更好的脫色效果。

圖4 不同培養(yǎng)條件下孔雀石綠脫色率隨時間變化曲線Fig.4 Decolorization rate of malachite greenat different times on different conditions

2.3.4 染料對菌體生長的影響 為探究染料對菌體生長的影響，菌體培養(yǎng)72 h時，向發(fā)酵液中加入15 mg/L的孔雀石綠。加入染料后，由于染料的特征吸收峰617 nm與細(xì)胞吸收峰620 nm相近，使得細(xì)胞表象吸光值增高。隨著染料的不斷降解，在以后的整個細(xì)菌生長過程中，染料組的細(xì)胞生物量均低于對照。結(jié)果表明三苯甲烷類染料孔雀石綠加速了細(xì)胞衰亡，對菌體生長有一定的不利影響。

3 結(jié)語

從無錫某木材廠中采集到的腐木及腐殖土的表層土樣分離到一株高產(chǎn)錳過氧化物酶的細(xì)菌J09，經(jīng)鑒定為草木犀中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）。該菌發(fā)酵所得的發(fā)酵液及粗酶液對孔雀石綠均有顯著的脫色效果，在酶活達到最高時，分別在發(fā)酵液和粗酶液中加入15 mg/L的孔雀石綠，在振蕩培養(yǎng)3 h后，其脫色率分別達到89.8%和78.5%；充足的氧氣利于該菌株脫色效率的提高；同時，研究表明孔雀石綠對該菌體生長有不利影響。

[1]武善軍.產(chǎn)木質(zhì)素降解酶真菌的分離及其發(fā)酵條件的研究[D].合肥：安徽大學(xué)，2010.

[2]魯時瑛，李華鐘，陳 堅，等.EDTA對木質(zhì)素過氧化物酶在染料脫色中的影響[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報，2002，21（4）：393-396.LU Shi-ying，LI Hua-zhong，CHEN Jian，et al.Effect of ethylenediamine tetraacetic acid on dye-decolorization by Lignin peroxidase[J].Journal of Wuxi University of Light Industry，200，21（4）：393-396.（in Chinese）

[3]李燕榮，周國英，胡清秀，等.食用菌生物降解木質(zhì)素的研究現(xiàn)狀[J].中國食用菌，2009，28（5）：3-6.LI Yan-rong，ZHOU Guo-ying，HU Qing-xiu，et al.Research advance on biodegradation of lignin mushroom[J].Edible Fungi of China，2009，28（5）：3-6.（in Chinese）

[4]郁紅艷，曾光明，牛承崗，等.細(xì)菌降解木質(zhì)素的研究進展[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2005，28（2）：107-109.YU Hong-yan，ZENG Guang-ming，NIU Cheng-gang，et al.Advances in biodegradation of lignin by bacteria[J].Environmental Science and Technology，2005，28（2）：107-109.（in Chinese）

[5]Ahmad M，Taylor CR，Pink D，et al.Development of novel assays for lignin degradation：comparative analysis of bacterial and fungal lignin degraders[J].The Royal Society of Chemistry，2010，6，815-821.

[6]Michizoe J，Okazaki S，Goto M，et al.Catalytic properties of lignin peroxidase ALip-P3 hosted in reversed micelles[J].Biochemical Engineering Journal，2001，8：129-134.

[7]吳薇，田世杰，頓寶慶，等.高效木質(zhì)素酶產(chǎn)生菌的分離篩選[J].食品科技，2010，35（1）：10-14.WU Wei，TIAN Shi-jie，DUN Bao-qing，et al.Separation and filtration of a strain of high effective lignin-modifying enzymes production[J].Food Science and Technology，2010，35（1）：10-14.（in Chinese）

[8]Archibald F S.A new assay for lignin-type peroxidases employing the dye azure B[J].Applied and Environmental Microbiology，1992，58（9）：3110-3116.

[9]LIU Li-hua，LIN Zhi-wei，ZHENG Teng，et al.Fermentation optimization and characterization of the laccase from Pleurotus ostreatus strain 10969[J].Enzyme and Microbial Technology，2009，44：426-433.

[10]HOU Hong-man，ZHOU Ji-ti，WANG Jing，et al.Enhancement of laccase production by Pleurotus ostreatus and its usefor the decolorization of anthraquinone dye[J].Process Biochemistry，2004，39：1415-1419.