羊快疫病原的分離與鑒定

陳振華

湖北省荊州市畜牧獸醫(yī)局，湖北荊州434020

羊快疫是由梭狀芽孢桿菌屬的腐敗梭菌引起的主要危害綿羊的一種急性、致死性傳染病，該病以發(fā)病突然、病程短及病羊真胃黏膜呈出血性壞死性炎癥為特征［1-2］。腐敗梭菌兩端鈍圓、革蘭氏染色呈陽(yáng)性，在肝臟漿膜上可形成階段不明顯的微彎曲的長(zhǎng)絲狀或階段明顯的鏈條狀菌落，幼齡菌體有鞭毛、無(wú)莢膜，可形成芽孢［3］。腐敗梭菌常以芽孢形式分布于低洼草地、熟耕地及沼澤中，羊采食了被污染的飼料和飲水后，芽孢隨之進(jìn)入羊的消化道，當(dāng)羊受到不良因素刺激致使機(jī)體抵抗力下降時(shí)，腐敗梭菌就會(huì)大量繁殖，產(chǎn)生外毒素，損害羊只消化道黏膜，引起中毒性休克，使羊迅速死亡［4］。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用病料為疑似羊快疫病羊的肺組織，由長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)室熊濤老師提供。

1.2 病料鏡檢

無(wú)菌取病料，涂片后進(jìn)行革蘭氏染色，并用顯微鏡觀察染色結(jié)果。

1.3 細(xì)菌的分離

用接種環(huán)無(wú)菌挑取病料，采用分區(qū)劃線的方法接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)。

1.4 分離細(xì)菌的培養(yǎng)特性研究

將厭氧肉肝湯培養(yǎng)基煮沸5min，隨即置冷水中冷卻，以排出培養(yǎng)基內(nèi)的空氣；接種前，先將液面石蠟處的管壁外部在酒精燈火焰上略烤，使石蠟與管壁分離；然后挑取單個(gè)菌落從石蠟與管壁間的空隙處插入培養(yǎng)基中；接種完后，將液面的石蠟烤融，使其平整地覆蓋液面，然后將其置于試管架上冷卻至石蠟?zāi)毯?，?7℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

1.5 分離細(xì)菌的生化鑒定

1）糖發(fā)酵試驗(yàn)。取用于糖發(fā)酵試驗(yàn)的葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、果糖和甘露糖6支生化管，挑取分離菌的單菌落分別接種于上述生化管中，37℃培養(yǎng)2～3d，觀察結(jié)果。培養(yǎng)基變?yōu)辄S色的為產(chǎn)酸，倒置的德漢氏小管內(nèi)有氣泡的為產(chǎn)氣。

2）過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。用接種環(huán)挑取分離菌的單菌落，置于潔凈試管內(nèi)，然后滴加3%過(guò)氧化氫溶液10mL，觀察結(jié)果。0．5min內(nèi)產(chǎn)生氣泡者為陽(yáng)性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性。

3）靛基質(zhì)試驗(yàn)（吲哚試驗(yàn)）。取用于做靛基質(zhì)試驗(yàn)的生化管2支，挑取分離菌的單菌落對(duì)其中1支進(jìn)行接種，另1支作為對(duì)照；37℃培養(yǎng)2d；然后于每管各加入乙醚3～4滴，搖動(dòng)數(shù)次，靜置1～3min；待乙醚上升后，沿試管壁緩慢加入吲哚試劑2滴，在乙醚和培養(yǎng)物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物者為陽(yáng)性反應(yīng)。

4）甲基紅試驗(yàn)。取用于做甲基紅試驗(yàn)的生化管2支，分別挑取分離菌的單菌落進(jìn)行接種，37℃培養(yǎng)2d，然后在其中1支試管中加入甲基紅試劑2滴，另1支作為對(duì)照。培養(yǎng)基變?yōu)榧t色者為陽(yáng)性，變黃色者為陰性。

5）明膠液化試驗(yàn)。取用于做明膠液化試驗(yàn)的生化管2支，用接種針挑取分離菌的單菌落對(duì)其中1支進(jìn)行穿刺接種，另1支作為對(duì)照；然后將2支生化管于20℃培養(yǎng)2～5d。由于明膠在20℃下為液態(tài)，所以觀察時(shí)需冰浴一段時(shí)間，若在冰浴后仍為液體，則說(shuō)明該菌對(duì)明膠有液化作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料涂片染色特性

鏡檢可見(jiàn)菌體兩端鈍圓，為單個(gè)或短鏈的桿狀菌，有的數(shù)個(gè)連接在一起形成長(zhǎng)短不等的長(zhǎng)絲狀，如圖1所示。

圖1 病料涂片的革蘭氏染色結(jié)果

2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

病料中的病原菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上形成薄沙狀菌落群，菌落微隆起、邊緣厚薄不均、呈淡灰色，如圖2所示。

圖2 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離的菌株

2.3 分離菌的培養(yǎng)特性

用厭氧肉肝湯培養(yǎng)基培養(yǎng)分離菌，可見(jiàn)肉湯變混濁，管底形成大量絮片狀白色沉淀（如圖3所示），有類似脂肪腐敗的氣味。

2.4 分離菌的生化鑒定試驗(yàn)

該批分離菌能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、果糖和乳糖，且產(chǎn)酸、產(chǎn)氣；不發(fā)酵甘露糖和蔗糖。該批分離菌的過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果為陰性，靛基質(zhì)試驗(yàn)結(jié)果為陰性，甲基紅試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，可以液化明膠。具體結(jié)果如圖4～8所示。

圖5 分離菌的過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果（左為過(guò)氧化氫，右為接種后的過(guò)氧化氫）

圖6 靛基質(zhì)試驗(yàn)結(jié)果（左為無(wú)菌加指示劑，右為有菌加指示劑）

圖7 甲基紅試驗(yàn)結(jié)果（左為含菌未加指示劑，右為含菌加指示劑）

圖8 明膠液化試驗(yàn)結(jié)果（左為不含菌，右為含菌）

綜合分離菌的染色特性、培養(yǎng)特性及生化鑒定結(jié)果，可確定病料中病原菌為專性厭氧的腐敗梭菌。

3 討 論

本試驗(yàn)使用普通的培養(yǎng)基和簡(jiǎn)易的厭氧培養(yǎng)方法，成功分離出了病料中專性厭氧的腐敗梭菌，簡(jiǎn)化了培養(yǎng)過(guò)程，確定了病料來(lái)源羊只所患疫病為羊快疫，為治療其它羊只提供了較好的依據(jù)。

［1］ 鄺泳娟．深圳市豬弓形體病的調(diào)查與防治［J］．中國(guó)獸醫(yī)科技，2002，2（12）：37-38．

［2］ 趙中興，范鋒，周永華，等．無(wú)錫地區(qū)豬弓形體感染血清學(xué)調(diào)查［J］．中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志，2003，15（6）：417-421．

［3］ 陸艷，李曉卉．青海省弓形體病流行病學(xué)調(diào)查［J］．中國(guó)獸醫(yī)雜志，2005（2）：30．

［4］ 張能貴，劉慶龍，范永嬋，等．上杭縣豬弓形體病的血清學(xué)調(diào)查［J］．福建畜牧獸醫(yī)，2006，28（1）：34．