楊一萍，駱 媛，王永安，范禮斌

(1.安徽醫(yī)科大學生命科學學院醫(yī)學遺傳學教研室，安徽合肥 230032;2.軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所軍事毒理學研究室，北京 100850)

近幾年缺血性腦血管病發(fā)病率、病死率及致殘率仍呈逐年上升趨勢，嚴重威脅人類健康，而腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，IRI)危害更大。腦IRI，是指各種原因造成腦部組織血液灌流量減少或停止，重新恢復血液灌流后，其損傷反而加重的現象。關于腦IRI發(fā)病機制，目前尚未完全闡明，但既往研究已證實，N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體與腦缺血再灌注所致的腦損傷存在密切關系［1］。NMDA受體是興奮性谷氨酸離子型受體的一種，主要存在于大腦皮質和海馬，有NR1，NR2，NR3和NR4四種離子類型。其中，NR2是重要的調節(jié)亞單位，有NR2A，NR2B，NR2C和NR2D 4個剪接體。研究發(fā)現，NR2A和NR2B均參與了IRI過程，但其在IRI發(fā)生中的表達變化和作用尚存爭議［2］，并且目前的研究多集中在RNA水平，缺乏蛋白質水平的研究。而在生物體內發(fā)揮功能效應的是蛋白質，故本研究采用實時熒光定量PCR，Western印跡法和組織病理學等方法，從mRNA和蛋白水平觀察腦IRI后大鼠大腦皮質NR2A和NR2B表達的變化，探討NR2A/2B的表達與大腦皮質神經元的損傷的關系，以期進一步明確NMDA受體亞單位在IRI中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物

健康成年 Sprague-Dawley大鼠，♂，體質量240～270 g，由維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號:SCXK(京)2006-2009。

1.2 試劑及器材

水合氯醛、肝素鈉、甲醛、二甲苯和乙醇購自國藥集團化學試劑有限公司;瓊脂糖和丙烯酰胺購自Merck公司;十二烷基硫酸鈉、雙-丙烯酰胺、AP、Tris堿、TEMED和甘氨酸購自 Amresco公司;Prime ScriptRRT reagent Kit With gDNA Eraser，SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒為TaKaRa公司產品;Trizol購自Invitrogen公司;抗NR2A單克隆抗體為Abcam公司產品;抗NR2B單克隆抗體為Millipore公司產品;抗β肌動蛋白多克隆抗體，HRP標記兔抗鼠IgG抗體，HE染色試劑盒均購自中杉金橋公司;BCA蛋白含量檢測試劑盒、蛋白酶抑制劑混合物、RIPA裂解液均為凱基生物公司產品;其他化學試劑均為分析純。MCAO栓線(2636-4A)購自北京沙東生物技術有限公司;RM2135石蠟切片機購自德國Leica公司，生物顯微鏡(BA400T)購自麥克迪奧實業(yè)集團有限公司;紫外分光光度計(UV-4802)購自尤尼柯儀器有限公司;熒光實時定量PCR儀、電泳儀、半干電轉膜儀和凝膠呈像儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.3 MCAO大鼠模型的評判標準

參考Zea Longa法，分別于麻醉清醒后對MCAO大鼠進行神經功能缺損評分:0分為無神經功能缺損癥狀;1分為不能完全伸展對側前爪，即左側前肢內收、屈曲;2分為自主運動時身體向左側轉圈;3分為身體向左側傾倒;4分為不能自主行走并伴有意識障礙。

模型納入標準:根據預實驗的結果神經功能評分為2～3分的大鼠梗死體積為(28±4)%;Bederson等［3］的研究發(fā)現線栓法制備的MCAO大鼠神經功能評分為2～3分對應的梗死體積在(27±6)% ～(28±5)%，說明建立的MCAO大鼠具有穩(wěn)定性和可復制性，故將復制成功的神經功能評分為2～3分的大鼠納入實驗組。

模型剔除標準:無明顯神經功能缺損表現或癥狀很輕及有嚴重意識障礙的大鼠;術中出血過多或蛛網膜下腔出血、MCA起始部或Willis環(huán)有凝血塊的大鼠。

1.4 MCAO大鼠模型的建立及分組

54只SD大鼠隨機分為6組:①假手術組;②再灌注后6，12，24，48及96 h組，每組各9只動物。大鼠術前禁食12 h，10%水合氯醛3 ml·kg-1腹腔麻醉后仰臥位固定，取頸部偏右側切口，分離右側頸總動脈 (common carotid artery，CCA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)和頸內動脈(internal carotid artery，ICA)。結扎ECA，將栓線尾部與CCA成30°角從CCA緩慢插入 ICA，插入長度為18～20 mm(從CCA分叉處計算)，固定栓線，縫合消毒，缺血2h后將栓線緩慢抽出實施再灌注，待大鼠清醒后進行神經評分。于各時間點再次麻醉，以肝素20 kU·L-1化生理鹽水灌流心臟，迅速取腦。由于半暗帶和梗死區(qū)的界限不易確定，為滿足無RNA酶的實驗要求，以肉眼觀察大腦皮質缺血再灌注損傷區(qū)與正常皮質之間的水腫線為界，實時定量PCR和Western印跡實驗的取材部位和HE染色觀察的部位均為水腫線以內包括半暗帶和梗死區(qū)的皮質組織。

1.5 HE染色觀察病理改變

每組各取3只完整大腦行4%甲醛固定，視交叉處冠狀面切片，二甲苯洗2次，每次5～10 min，95%乙醇洗2次，每次3 min，2 min，80%乙醇1 min，蒸餾水1 mim，蘇木精液染色12 min，流水稍洗去蘇木精液1 ～3 s，1%鹽酸乙醇1 ～3 s，稍水洗 20 s，促藍液返藍15 s，流水沖洗15 min，蒸餾水過洗2 s，0.5%蘇紅液染色2 min，蒸餾水稍洗2 s 80%乙醇稍洗1～2 s，95%乙醇洗2次，每次3 min，無水乙醇10 min，二甲苯洗3次，每次3 min，用滴加中性樹脂的蓋玻片封片，通風櫥內吹干，光學顯微鏡下觀察并照相，光學顯微鏡下觀察病理改變。

1.6 RT-PCR檢測NR2A，NR2B mRNA的表達

1.6.1 RNA 抽提和逆轉錄 cDNA

取各時間點MCAO大鼠梗死區(qū)及半暗帶大腦皮質約100 mg，Trizol法抽提大腦皮質總RNA，加適量RNase-free水溶解。紫外分光光度計檢測A260/A280吸光度，計算RNA的濃度和純度。取5μl RNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳，恒壓120 V，15 min，凝膠成像儀顯示，可見28 S，18 S和5 S三條帶，其中前兩條帶的相對亮度為2∶1說明RNA完整性好，無明顯降解。A260/A280均在1.8～2.0，說明純度較好，沒有蛋白和苯酚的污染。

在1μg總 RNA樣本中加入 gDNA Eraser 0.5 μl，5×緩沖液2 μl無 RNase水至10 μl。反應條件:42℃變性2 min，以消除可能存在的gDNA污染。0.5 μl PrimeSeript RT Enzyme，0.5 μl Oligo dT 引物50 μmol·L-1，0.5 μl隨即引物(100 μmol·L-1)，5 ×緩沖液 2μl，已去除 gDNA 的 RNA 10μl，加無RNase水至 20 μl。反應條件:37℃ 15 min，85℃5 s。反應產物置于-20℃冰箱長期保存。

1.6.2 實時熒光定量RT-PCR

根據 NR2A，NR2B和 β肌動蛋白基因在GenBank的序列，經Primer Express3.0軟件設計引物(表1)，并由Invitrogen公司合成。應用SYBR Green實時定量PCR試劑盒，以10倍稀釋、5個濃度梯度的cDNA樣本，分別建立NR2A，NR2B和β肌動蛋白基因擴增的標準曲線，確定它們的擴增效率并采用最佳擴增效率(E=90% ～110%)的反應體系條件進行檢測。25μl反應體系包括:SYBR Ex Taq 12.5 μl，0.5 μl上游引物 10 μmol·L-1，0.5 μl下游引物 10 μmol·L-1，0.5 μl cDNA 10 μmol·L-1，11μl ddH2O。擴增條件:95℃預變性 30 s，95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)，每次循環(huán)結束后采集熒光。為確定擴增反應的特異性，循環(huán)結束后進行融解曲線分析，條件如下:65～95℃，每5 s上升0.5℃。每組樣本設定無cDNA模板反應孔為陰性對照;每個樣本進行3次重復，重復間允許的差異小于0.5 ct。用BioRad ManagerTM軟件分別測定每個樣本NR2A/2B的相對拷貝數。

Tab.1 Primer sequences of genes sequences in real time-PCR

1.7 Western印跡法檢測NR2A和NR2B蛋白表達

取各時間點MCAO大鼠梗死區(qū)及半暗帶大腦皮質約100 mg，加入蛋白裂解液1 ml，冰上超聲破碎，4℃，9168×g，離心15 min制備組織蛋白勻漿液，BCA法測定蛋白濃度。分別灌制8%和5%SDS-聚丙烯酰胺分離膠和濃縮膠，進行SDS-PAGE凝膠電泳。半干轉印法60 mA恒流轉膜30 min將蛋白轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加一抗，分別為抗NR2A單克隆抗體(1∶5000)、抗NR2B單克隆抗體(1∶1000)，內參抗 β肌動蛋白抗體(1∶1000)，4℃孵育過夜。次日 TBST洗膜后加入HRP標記的山羊抗兔/山羊抗小鼠二抗(1∶7000)，室溫孵育1 h。ECL化學發(fā)光檢測雜交信號，X線片壓片曝光，凝膠圖像分析其積分光密度值，NR2A，NR2B蛋白的相對表達水平用β肌動蛋白的表達量來校正，即目的蛋白相對表達量 =IANR2A蛋白/IAβ肌動蛋白。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠大腦皮質改變

與假手術組相比，再灌后6 h，腦梗死區(qū)顏色變淺，正常神經元細胞數減少、排列紊亂，組織結構疏松、血管擴張(圖1B箭頭所示)，錐體細胞核固縮成圓形或橢圓形;隨著再灌注時間的延長，腦損傷程度逐步加重，12 h時可見血管內淤血(如圖1C箭頭所示);再灌后24 h損傷最嚴重，梗死區(qū)出現大量的核固縮核溶解等典型的細胞凋亡特征性表現，幾乎看不到正常神經元細胞(如圖1D箭頭所示);48 h出現大面積角質化(如圖1E箭頭所示)，96 h可見炎癥細胞浸潤(如圖1F箭頭所示)。

Fig.1 Pathological changes of rat cerebral cortex at different time points after ischemia(2 h)reperfusion injury(I/R)(HE ×400).A:sham;B-F:6，12，24，48 and 96 h after I/R.

2.2 局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦皮質NR2A/2B mRNA表達水平

采用實時熒光定量PCR技術，檢測了MCAO大鼠皮質NMDA受體亞單位NR2A/2B mRNA在再灌注后不同時間表達變化(表2)。結果表明，與假手術組相比，再灌注后6 h皮質NR2A mRNA水平表達顯著降低(P＜0.01)，再灌注24 h，NR2A/2B均降至最低，NR2A∶NR2B 的比值由1∶1變?yōu)?1∶2;而后NR2A及NR2B表達又逐漸升高，至再灌注后96 h，NR2A∶NR2B 恢復至1∶1。

Tab.2 mRNA Expression of NR2A/2B in the cerebral cortex of rat at different time points after I/R

2.3 局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦皮質NR2A/2B蛋白表達水平

圖2結果顯示，再灌注后6 h，大鼠大腦皮質NR2A/2B蛋白表達開始下調，NR2B與假手術組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);此后，兩者進一步下調，并于再灌后24 h降至最低(P＜0.01)(圖2);再灌后48 h出現上調，96 h兩者蛋白的表達也為1∶1且已接近正常水平。與NR2B蛋白表達不同，盡管NR2A蛋白表達總體呈先降低后升高趨勢;但在觀察的整個時間點內，NR2A蛋白有顯著統(tǒng)計學意義的下調僅出現在再灌后24 h(P＜0.05)，在其他各時間點，NR2A蛋白表達與假手術組相比未見顯著改變。

Fig.2 Expression of NR2A/2B protein in the cerebral cortex of rat at different time points after I/R.C was the semiquantitative result of A and B.1.sham，2.6 h after I/R;C:12 h after I/R;D:24 h after I/R;E:48 h after I/R;F:96 h after I/R.n=6.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，compared with sham group.

3 討論

關于NR2主要受體亞單位NR2A/2B在IRI后不同時間表達變化，目前仍存在明顯爭議。Liu等［4］發(fā)現IRI后，海馬神經元 CA1區(qū)NR2A/2B的mRNA水平呈先降低后增高趨勢，NR2B的變化尤為顯著;而 Cascón等［5］則認為 NR2B 表達下調與NMDA受體介導的興奮性毒性有關，NR2A表達上調可能與促進IRI中的細胞存活有關;Dos-Anjos等［6］研究證實，在 IRI早期，NR2A mRNA 與 2B mRNA表達比例失衡，引發(fā)NMDA受體結構和功能改變，可能是導致神經元損傷的重要原因。需要說明的是，這些研究，多單純局限于mRNA或蛋白水平;但 mRNA水平并非絕對預示其相應蛋白水平［7］，因此，本研究在同一個動物模型上，同時開展mRNA及其相應蛋白表達，以及腦皮質病理學改變相關性的研究。

本實驗組織病理學結果表明，腦缺血再灌后6 h，大腦皮質即出現明顯病理學改變，再灌后24 h，損傷最為嚴重;RT-PCR及Western印跡法研究結果發(fā)現，在再灌后6 h，最為明顯的改變是NR2B蛋白水平的顯著下調;之后至96 h，NR2A/2B mRNA及蛋白表達均呈現先降低再升高的趨勢，24 h至最低;除此之外，在再灌后12 h及24 h，存在NR2A及NR2B mRNA比例失衡，其mRNA比值由1∶1升至1∶2，至96 h兩者的比值達到1∶1，蛋白表達也已接近假手術組水平。這表明再灌24 h后NR2A/2B的基因和蛋白表達均處于最低水平且兩者的mRNA比值發(fā)生改變與24 h病理損傷嚴重之間存在時間一致性，因此推測在IRI中神經元的損傷可能與NR2A/2B的表達變化有關。

NR2是NR1的調節(jié)亞單位，多數研究認為含有NR2A的NMDA受體主要在缺血耐受機制中發(fā)揮保護作用，而含有NR2B的NMDA受體及其介導的信號分子在興奮性毒性和缺血引起的神經元死亡中起主要作用［5，8］。在本實驗中，NR2B 蛋白表達在腦缺血再灌注損傷后6 h即出現顯著下調，則從另一個角度證實了NR2B的表達降低可能是引發(fā)大腦皮質病理學改變的始動因素;而此后NR2A/2B的不均衡下調，導致NR2A的保護性調控作用降低、NR2B的損傷性調控作用增強，進而加重NMDA受體復合體結構和功能改變，則可能是進一步引發(fā)大腦皮質病理學改變的繼發(fā)原因。再灌注24 h后NR2A/2B的表達開始上調，再灌注96 h時，不管基因水平NR2A∶NR2B約為1∶1，蛋白的表達量已接近正常水平，說明NR2A和NR2B分別作為NMDA復合體中參與保護和損傷的重要調節(jié)亞單位，隨著再灌注時間的延長它們能通過自身的調節(jié)達到與正常水平相似的平衡狀態(tài)，這可能是大鼠自身在腦缺血再灌注損傷中的應激性保護。這種上調性保護與Liu等［4］報道的NMDA受體過度表達參與腦缺血再灌注損傷的興奮性氨基酸毒性損傷并不矛盾，因為再灌注96 h NR2A/2B的表達仍低于正常水平。需要說明的是，RNA和蛋白具體表達量在每個時間點不盡一致，這是由于蛋白表達可以受轉錄調控，也可以受翻譯水平的調控，而翻譯水平的調控可以導致蛋白表達和RNA水平不成比例［9］。

目前臨床多選用氯胺酮、美金剛等非競爭性NMDA受體拮抗劑治療IRI，但均難以達到理想效果，甚至加重腦病理損傷的發(fā)生［10-11］。究其原因，主要在于上述藥物均為非受體亞型選擇性NMDA受體拮抗劑;且在使用過程中，未重點考慮NR2不同亞型在損傷后不同時間表達變化。而本研究結果則發(fā)現，NMDA受體亞單位在IRI發(fā)作過程中，其表達存在亞單位特異性。因此，依據NR2A/2B在腦缺血再灌注后不同時間表達變化，選用相應的NR2受體亞單位激動劑或拮抗劑進行選擇性治療，將成為今后IRI的治療新方向。

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