宋 瑩，王洪新，張 晶，喻曉春，魯美麗，趙素玲，周振華

(1.遼寧醫(yī)學院藥物研究所心腦血管藥物研究重點實驗室，遼寧錦州 121001;2.中國中醫(yī)科學院實驗中心，北京 100700)

心肌肥厚發(fā)生過程中，心肌細胞能量代謝異常，游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)的β氧化能力降低，細胞的葡萄糖攝取和酵解能力提高，造成FFA和糖酵解產(chǎn)物乳酸(lactic acid，LAC)積累、胞質(zhì)酸化、線粒體功能降低和膜脆化，從而導致心肌肥厚和心衰［1］。黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)是黃芪的主要成分之一，由APSⅠ和Ⅱ組成;APSⅠ是雜多糖，由D-葡萄糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖組成;APSⅡ為葡聚糖，由α-(1→4)-D-糖苷鍵連接而成［2］。APS 具有提高免疫力、抗氧化［3］、抗自由基和降血糖血脂等［4］藥理作用，對體外血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導心肌細胞肥大有一定的抑制作用［5］。本實驗通過觀察 APS對腹主動脈縮窄(abdominal aorta construction，AAC)致大鼠心肌肥厚、心肌結(jié)構(gòu)、心肌細胞能量代謝及細胞線粒體功能的影響，探討APS對心肌肥厚影響及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑與儀器

APS(陜西森弗生物技術(shù)有限公司)，批號:HQ090312，純度98%。LAC測定試劑盒，F(xiàn)FA測定試劑盒，總蛋白測定試劑盒(考馬斯亮藍法)(南京建成生物工程研究所)。線粒體膜電位測定試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。RT-PCR所用試劑(大連寶生物公司)。TC-512型梯度PCR分析儀(英國Techine公司)，全自動凝膠成像系統(tǒng)(英國Syngene公司)。Leica sp5型激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 動物、模型制備及分組

SD大鼠60只，清潔級，♀♂各半，體質(zhì)量180～200 g，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(遼)2003-0007。取大鼠48只，參照文獻［6］，采用結(jié)扎大鼠腹主動脈制備心肌肥厚模型。術(shù)前禁食12 h，自由飲水，ip給予水合氯醛3 mg·kg－1麻醉后，右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺上，分離暴露左腎動脈上方腹主動脈，用針尖磨鈍的8號注射針頭與腹主動脈一起結(jié)扎，然后小心拔出針頭，造成腹主動脈部分狹窄;手術(shù)動物分為4組:AAC 模型組，APS200，400 和800 mg·kg－1組。另取12只假手術(shù)對照組僅分離腹主動脈不行縮窄術(shù)。手術(shù)后1周APS組開始ig給藥，AAC組及假手術(shù)組ig給予同等容量凈水，連續(xù)11周。

1.3 監(jiān)測血流動力學指標

大鼠禁食12 h后稱取體質(zhì)量(body mass，BM)，用水合氯醛3 mg·kg－1麻醉，用 BL.420型四道生理記錄儀測定大鼠的左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左心室內(nèi)壓最大升降速率(maximum rate of rise/decrease of LVSP，±d p/d tmax)。

1.4 心肌肥厚指數(shù)的測定

麻醉開胸取心臟，稱全心濕重(heart mass，HM)和左心室濕重(left ventricle wet mass，LVM)，計算心臟質(zhì)量指數(shù)(heart mass index，HMI)=HM/BM(mg·g－1)，左心室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index，LVMI)=LWH/BM(mg·g－1)。

1.5 HE染色檢測心肌組織改變

取心尖組織迅速固定于4%甲醛中，石蠟包埋。石蠟橫斷面連續(xù)切片5～6片，厚度約5μm，切片常規(guī)脫蠟脫水，做常規(guī)HE染色。

1.6 測定心肌生化指標

取心尖組織100 mg，置入含0.9%生理鹽水0.9 ml的試管中，用勻漿器勻漿，得到組織勻漿。取心肌組織勻漿按試劑盒方法測定心肌FFA和LAC，考馬斯亮藍法測定心肌總蛋白。

1.7 RT-PCR測定心鈉素(atrial natriuretic peptide，ANP)mRNA 表達

取約100 mg大鼠心臟組織放于玻璃研磨器內(nèi)，加入Trizol溶液，按試劑盒要求操作，提取總RNA。取約1μg總 RNA，進行反轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄條件為:42℃ 60 min，99℃ 2 min，4℃保存。ANP 的引物序列(5'－3')為GGCTCCTTCTCCATCACCAA TGT TAT CTT CGG TAC CG，內(nèi)參 GAPDH的引物序列(5'－3')為CAA AGT TGT CAT GGA TGA CCA TGG AGA AGG CTGGG。上述引物由北京奧科生物有限公司合成，滅菌水溶解并配制成100μmol·L－1的上下游引物混合液，使用濃度為20μmol·L－1。PCR反應條件:預變性94℃ 4 min，變性94℃ 45 s，退火60℃ 45 s，延伸 72℃ 45s，終末延伸 72℃ 5 min，4℃終止，32循環(huán)。循環(huán)擴增結(jié)束后，取6μl產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后，置于凝膠成像系統(tǒng)進行觀察和分析。置于凝膠成像系統(tǒng)進行觀察，用凝膠圖像分析系統(tǒng)軟件GENETOOLS對RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶進行密度分析，以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)ANP和 GAPDH密度分析結(jié)果比值，計算得到ANP的相對表達量。

1.8 心肌細胞線粒體膜電位(MMP)的測定

按照文獻［7－8］方法制備肥厚心肌的單個心室肌細胞 。取(1～6)×105細胞，重懸于0.5 ml KB 液〔mmol·L－1:L-谷氨酸 70，?；撬?20，KCl 40，EGTA 0.5，KH2PO420，MgCl23，葡萄糖10，HEPES 10，KOH 70)中保存。加入0.5 ml JC-1(5，5'，6，6'-四氯-1，1'，3，3'-四乙基苯咪羰花青碘化物)染色工作液，混勻。細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。參照說明書按試劑盒要求操作，最后用適量JC-1染色緩沖液重懸。用激光共聚焦顯微鏡觀測。激光共聚焦顯微鏡檢測JC-1單體時把激發(fā)光設置為490 nm，發(fā)射光設置為530 nm，得到綠色熒光圖像;檢測JC-1聚合物時，把激發(fā)光設置為525 nm，發(fā)射光設置為590 nm，觀察得到紅色熒光圖像。以紅色和綠色熒光強度的比值表示 MMP［9－10］。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 APS對心肌肥厚大鼠心臟指數(shù)的影響

表1結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，AAC模型組大鼠HMI和LVMI明顯增加(P＜0.01)，表明大鼠已出現(xiàn)心臟功能障礙。與AAC模型組相比，APS 200，400 和800 mg·kg－1組大鼠 HMI和 LVMI明顯降低(P＜0.05，P ＜0.01)，說明 APS可有效減輕AAC所致的心肌肥厚。

Tab.1 Effect of Astragalus polysaccharide(APS)on heart mass index(HMI)and left ventricular mass index(LVMI)in abdominal aorta constriction(AAC)rats

2.2 APS對心肌肥厚大鼠血流動力學的影響

表2結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，AAC模型組大鼠 LVSP，LVEDP和 ±d p/d tmax明顯增加(P＜0.05)。與 AAC 模型組相比，APS 800 mg·kg－1組大鼠LVEDP和 ±d p/d tmax明顯降低(P ＜0.01，P ＜0.05)，APS 400 mg·kg－1LVSP 和 +d p/d tmax明顯降低(P ＜0.05)，APS 200 mg·kg－1組無明顯改變。

2.3 APS對心肌肥厚大鼠心肌病理變化的影響

Fig.1 Effect of APSon myocardial tissue pathogenic changes of AAC rats(×200).A:sham group;B:AAC model group;C:model+APS 200 mg·kg－1;D:model+APS 400 mg·kg－1;E:model+APS800 mg·kg－1.

由圖1可見，HE染色光鏡下假手術(shù)組細胞形態(tài)正常，心肌纖維排列整齊(圖1A);AAC模型組心肌纖維束較寬大，肌纖維間隙疏松水腫，間隙增寬，心肌細胞排列紊亂，肌纖維增粗肥大，組織中可見炎癥細胞浸潤間質(zhì)增大(圖 1B)。APS 400 mg·kg－1(圖1D)和800 mg·kg－1(圖1E)組病理變化與AAC模型組相比明顯改善，心肌纖維束縮小，間隙變窄，心肌細胞排列較整齊，組織中炎癥細胞浸潤間質(zhì)變小。

2.4 APS對心肌肥厚大鼠 ANP mRNA表達的影響

如圖2和表3所示，與假手術(shù)組相比，AAC模型組 ANP mRNA的表達增加，為假手術(shù)組的3.4倍(P＜0.01)。與模型組相比，APS 400 和800 mg·kg－1組ANP mRNA 表達明顯下降，分別下降了58%和70%(P＜0.05)。表明APS可以抑制AAC致肥厚心肌ANP mRNA表達。

Fig.2 Effect of APS on atrial natriuretic peptide(ANP)mRNA level in AAC rats by RT-PCR.See Tab.1 for the legend.±s，n=5.Lane 1:sham group;lane 2:AAC model group;lane 3:model+APS 200 mg·kg－1;lane 4:model+APS 400 mg·kg －1;and 5:model+APS 800 mg·kg －1.

Tab.3 Effect of APSon mRNA level of ANP

Tab.2 Effect of APS on hemodynamic paramerters in AAC rats

2.5 APS對心肌肥厚大鼠左心室肌組織LAC和FFA含量的影響

表4結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，AAC模型組大鼠左心室肌組織LAC含量是假手術(shù)組的1.38倍(P＜0.01)。與模型組相比，APS 200，400 和800 mg·kg－1組 LAC 水平明顯降低(P ＜0.05);APS 800 mg·kg－1組與假手術(shù)組水平相當。與假手術(shù)組相比，AAC模型組大鼠左心室肌組織的FFA含量顯著升高，是假手術(shù)組的1.67倍。APS 200，400和800 mg·kg－1組可顯著降低左心室肌組織FFA的含量(P ＜0.01)。

Tab.4 Effect of APSon contents of lactic acid(LAC)and free fatty acids(FFA)in AAC rats

2.6 APS對心肌細胞線粒體膜電位影響

表5和圖3顯示，與假手術(shù)組相比，AAC模型組MMP顯著降低(P＜0.01);與AAC模型組相比，APS400和 800 mg·kg－1組 MMP顯著增高(P＜0.01)，APS 200 mg·kg－1組差異不顯著。

Tab.5 Effect of APS on mitochondrial membrane potential(MMP)in AAC rats

Fig.3 Effect of APSon mitochondrial membrane potential(MMP)of hypertrophic cardiomyocytes induced by AAC in rats.A:The red color shows the expression of MMP at λem=530 nm.B:The green color shows the expression of MMP atλem=590 nm.See Tab.1 for the legend.±s，n=5.1.sham group;2.AAC model group;3.model+APS 200 mg·kg－1;4.model+APS 400 mg·kg－1;5.model+APS 800 mg·kg－1.

3 討論

心肌肥厚是多種心血管病的共同病理過程，也是心力衰竭發(fā)生的結(jié)果。腹主動脈狹窄是由手術(shù)阻礙心臟射血的后負荷增大，以后心臟出現(xiàn)的代償反應，導致心肌肥厚。ANP的合成和釋放增加是心肌肥厚、心肌細胞增大的一個標志性變化。12周時測定HMI和LVMI較正常對照組明顯升高，ANP的mRNA表達顯著增高，表明此時大鼠已經(jīng)出現(xiàn)心肌肥厚，主要是左心室肥厚。大鼠腹主動脈縮窄后，機體為適應心臟后負荷明顯增加，增高交感神經(jīng)系統(tǒng)活性，此時心臟工作效率基本正常，處于心功能代償期，在體觀察表現(xiàn)為左心室收縮功能增強而舒張功能明顯下降［11］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，給予APS處理后，大鼠HMI和LVMI明顯低于AAC模型組，血流動力學指標相對于AAC模型組明顯改善，ANP的mRNA表達顯著低于模型組，證明APS具有抑制腹主動脈狹窄大鼠心肌肥厚的作用。

在心肌肥厚發(fā)生過程中，心肌細胞的能量產(chǎn)生機制由正常情況下以脂肪酸氧化供能為主轉(zhuǎn)而更多地依賴于葡萄糖氧化和酵解［12］。這些現(xiàn)象提示心肌肥厚發(fā)生中存在能量供應過分緊張的狀態(tài)。產(chǎn)能機制的變化使FFA和葡萄糖酵解產(chǎn)物LAC的堆積在心肌肥厚中突出表現(xiàn)出來，引起胞質(zhì)酸化導致線粒體膜脆化。本實驗通過測定心肌FFA的含量，我們觀察到AAC模型組的心肌FFA含量遠高于假手術(shù)組，證明了之前對心肌肥厚FFA堆積的說法成立。另外AAC模型組的心肌LAC含量增高也可進一步說明心肌肥厚細胞產(chǎn)能機制由有氧氧化向無氧酵解轉(zhuǎn)化，能量底物從以脂肪酸為主逐漸地更多轉(zhuǎn)向葡萄糖;但葡萄糖產(chǎn)能的效率較脂肪酸低，導致心肌處于“能量饑餓狀態(tài)”，造成了LAC含量過高［13］。對于APS組FFA和LAC的含量降低，由此推測APS可能通過回復正常心肌細胞產(chǎn)能機制的調(diào)節(jié)來抑制心肌肥厚。

線粒體是細胞進行能量代謝的主要場所。MMP是反映線粒體功能的重要生物能量學參數(shù)，其電位值大小可以直接反映線粒體功能的變化。MMP是線粒體保持穩(wěn)定的重要條件，當線粒體膜完整性遭到破壞時，MMP下降，線粒體氧化磷酸化功能障礙，呼吸鏈解偶聯(lián)，最終可導致細胞能量產(chǎn)生異常、凋亡或壞死。研究表明，F(xiàn)FA和LAC的堆積胞質(zhì)酸化，線粒體膜兩側(cè)的pH梯度和電位梯度變化，使膜電位發(fā)生變化［14－15］，同時線粒體膜完整性遭到破壞，最終可導致細胞能量產(chǎn)生異常、凋亡或壞死。本實驗建立的AAC心肌肥大模型組的MMP明顯低于假手術(shù)組，經(jīng)過APS處理后MMP明顯增高。提示APS能夠通過提高MMP，對線粒體具有一定的保護作用，提高線粒體的活力。

綜上所述，APS能夠有效抑制AAC模型大鼠心肌肥厚，其機制可能與改善心肌能量FFA和LAC代謝紊亂和提高線粒體的活力有關(guān)，這為臨床防治心肌肥厚提供新的思路。然而，APS是如何作用致FFA和LAC減少以達到保護線粒體的目的的具體機制有待進一步實驗探討。

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