鄧新榮，向?qū)W琴，李鳳林，樊彩云，劉子華，陳 陽，羅志福，

（1.中國原子能科學(xué)研究院 同位素研究所，北京 102413；2.中國原子能科學(xué)研究院 核工業(yè)401醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 102413）

惡性腫瘤患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的幾率較高，腫瘤轉(zhuǎn)移到骨上，會出現(xiàn)伴隨著骨質(zhì)溶解性的骨破壞，其癥狀為骨痛、病理性骨折、脊椎壓迫和高鈣血癥。超過70%的骨轉(zhuǎn)移癌患者會出現(xiàn)劇烈而持續(xù)性骨痛，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1］。

177Lu是一種很有潛力的放射性治療用核素。177Lu具有適宜的物理半衰期（6.7d），發(fā)射的β－粒子在組織中的平均射程小于200μm，適合殺死癌細(xì)胞。177Lu發(fā)射的γ射線可用于單光子發(fā)射計算機(jī)斷層成像術(shù)（Single－Photon Emission Computed Tomography，SPECT）顯像，以監(jiān)測和指導(dǎo)治療過程。177Lu較長的半衰期為其生產(chǎn)、產(chǎn)品的質(zhì)量分析和質(zhì)量控制以及對遠(yuǎn)離核素生產(chǎn)地點的供應(yīng)提供了方便；也可減少多次注射給病人帶來的痛苦。177Lu可以通過反應(yīng)堆輻照產(chǎn)生，具有低成本和易得性，因此適用于制備放射性藥物［2］。在治療骨轉(zhuǎn)移癌疼痛的應(yīng)用中，177Lu 標(biāo)記的膦酸鹽類化合物成為研究熱點［3－6］。

1，4，7，10－四氮雜環(huán)十二烷－1，4，7，10－四甲撐膦酸（1，4，7，10－tetraazacyclododecane－1，4，7，10－Tetraaminomethylenephosphonate，DOTMP）是1，4，7，10－四氮雜環(huán)十二烷（1，4，7，10－tetraazacyclododecane，cyclen）的一種衍生物，是一種多齒氨基亞甲基膦酸類配體，可與多種核素形成穩(wěn)定配合物。近幾年，國外已經(jīng)研究了應(yīng)用不同放射性核素標(biāo)記的DOTMP治療骨轉(zhuǎn)移癌引起的疼痛，并且取得了一些進(jìn)展［7－10］。本研究擬以1，4，7，10－四氮雜環(huán)十二烷為主要原料合成DOTMP，對其進(jìn)行177Lu 標(biāo)記，并對177Lu－DOTMP在骨轉(zhuǎn)移癌模型鼠中的分布和在健康大白兔體內(nèi)的顯像進(jìn)行研究，考察其對骨的靶向性。

1 主要實驗材料

1.1 實驗試劑和實驗動物

1，4，7，10－四氮雜環(huán)十二烷：美國Sigma公司產(chǎn)品；天然三氧化二镥（Lu2O3）：美國Alfa Aesar產(chǎn)品；37%甲醛溶液（HCHO）、無水亞磷酸（H3PO3）、濃鹽酸（HCl）等試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑公司。

177LuCl3溶液：參考文獻(xiàn)［7］由反應(yīng)堆制備177Lu，用1.0mL 0.2mol／L 鹽酸溶液溶解所得177Lu得到177LuCl3溶液，活度為919GBq。

小鼠S180肉瘤細(xì)胞：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院提供。

昆明小鼠：雄性，4～5 周齡，體重18～20g，25只，北京華阜康生物科技股份有限公司提供；日本大耳白兔：雄性，體重2.6kg，1只，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。

1.2 主要儀器

RE－52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DF－2磁力加熱攪拌器：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；AR2130電子天平：梅特勒－托利多儀器上海有限公司；XZ－2 真空油泵：上海真空泵廠；DZX－3真空干燥箱：上海福馬實驗設(shè)備有限公司；RM－905a放射性活度計：中國計量科學(xué)研究院；Wizard 1470 全自動γ 計數(shù)儀：美國Perkin Elmer公司產(chǎn)品；AR－2000放射性薄層掃描儀：美國Bioscan 公司；Mili－Q 超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司；Whatman 濾紙（3 mm）：英國Whatman公司；e.cam duet SPECT 顯像儀：德國Siemens公司。

2 實驗方法

2.1 DOTMP的合成和標(biāo)記

按照文獻(xiàn)［12］方法確定合成方案，其合成路線示于圖1。以0.5g 1，4，7，10－四氮雜環(huán)十二烷為原料，在鹽酸維持強(qiáng)酸性條件下加入亞磷酸和37%甲醛溶液，回流2h，得到粗產(chǎn)物，以丙酮重結(jié)晶。

圖1 DOTMP 的合成路線

DOTMP合成和鑒定后，依據(jù)文獻(xiàn)［13］的標(biāo)記條件對DOTMP 進(jìn)行放射性177Lu 標(biāo)記。采用放射性色層掃描儀測定標(biāo)記率。

2.2 177 Lu－DOTMP 在荷瘤小鼠體內(nèi)的生物分布

2.2.1 小鼠骨轉(zhuǎn)移癌動物模型的建立

在體外培養(yǎng)細(xì)胞株小鼠S180瘤細(xì)胞后，用PBS懸浮至3×107／mL，以昆明小鼠為宿主，進(jìn)行腹水傳代。每只小鼠腹腔注射100μL 瘤細(xì)胞，飼養(yǎng)9d后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，三代后可用于皮下肌肉接種實驗。抽取荷S180瘤小鼠腹水，對瘤細(xì)胞進(jìn)行臺盼蘭染色后計活細(xì)胞數(shù)，用生理鹽水稀釋至107／mL。每只小鼠右后肢股骨旁沿骨膜接種100μL 約106個癌細(xì)胞。在SPF 級動物房中常規(guī)飼養(yǎng)，觀察腫瘤生長情況，約10d后腫瘤細(xì)胞侵蝕入骨，斷頸處死動物，分別取左右雙側(cè)腿骨，進(jìn)行雙側(cè)骨組織病理對比分析。

另取25只昆明小鼠，依照上述方法制作荷瘤小鼠，飼養(yǎng)于SPF級動物房，觀察腫瘤生長情況，待腫瘤長至約0.8cm3用于生物分布實驗。

2.2.2177Lu－DOTMP在荷瘤小鼠體內(nèi)分布

取25只荷瘤昆明種小鼠，隨機(jī)分成5組，每組5只。經(jīng)尾靜脈注射177Lu－DOTMP 溶 液100μL（約0.22 MBq），分別于注射后1、3、24、48h和6d 處死動物，取血、心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、腫瘤、頭蓋骨和雙側(cè)脛骨，稱重并測量其γ計數(shù)，計算出單位質(zhì)量臟器攝取放射性活度占注入總活度的百分率（%ID／g）。

2.3 177Lu－DOTMP在健康兔體內(nèi)的顯像

取1只健康日本大耳白兔，經(jīng)耳緣靜脈注射1.0 mL177Lu－DOTMP（約150 MBq），分別于22h和46h顯像，并對比顯像效果。約于顯像前10min，再經(jīng)耳緣靜脈注射1.5mL 5%巴比妥鈉溶液麻醉動物。選擇能窗113keV 進(jìn)行顯像，顯像數(shù)據(jù)在計算機(jī)系統(tǒng)256×256 矩陣中進(jìn)行記錄與分析。每次采集計數(shù)為500 000。

3 結(jié)果與討論

3.1 DOTMP的合成與分析鑒定

以1，4，7，10－四氮雜環(huán)十二烷，亞磷酸和甲醛等為原料，按照文獻(xiàn)［8］的方法合成DOTMP，并經(jīng)過重結(jié)晶得到產(chǎn)物，產(chǎn)率為63%。合成的DOTMP 的紅外光譜中有4 個典型吸收峰：3 138、2 855、1 683、1 455、1 288cm－1。3 138cm－1為羥基伸縮振動峰，2 855cm－1是亞甲基對伸縮振動峰，1 683cm－1為P－O 伸縮振動峰，1 455cm－1是C—P單鍵的伸縮振動，1300～900cm－1區(qū)域 是C—N 鍵的伸縮振動，P＝O 等雙鍵的伸縮振動吸收。

DOTMP的1H－NMR 數(shù)據(jù)（D2O，δ）：3.16～3.20（—N—CH2—PO3H2），3.20～3.50（—N—CH2—CH2—N）。

DOTMP的質(zhì)譜ESI－MS數(shù)據(jù)（M—1）相對分子質(zhì)量為547.2，DOTMP的理論相對分子質(zhì)量為548.1，說明所合成的產(chǎn)物為目標(biāo)產(chǎn)物。

本研究采用的合成方法是目前報道中常用的合成方法，以1，4，7，10－四氮環(huán)十二烷為母核在四個相同位置引入膦酸亞甲基，所得產(chǎn)率也與文獻(xiàn)報道相似。

在選定的實驗條件下，177Lu－DOTMP 的標(biāo)記率為99.4%。經(jīng)生理鹽水稀釋后，用于生物分布實驗或日本大耳白兔顯像研究。

3.2 177Lu－DOTMP在荷瘤小鼠體內(nèi)生物分布

3.2.1 動物模型的建立

模型小鼠雙側(cè)股骨組織病理切片于光學(xué)顯微鏡下觀察，結(jié)果示于圖2。

圖2 模型小鼠雙側(cè)股骨組織病理

比較圖2左右兩張圖片可以看出，在接種小鼠S180瘤細(xì)胞側(cè)的腫瘤細(xì)胞生長、浸潤成股骨旁肉瘤，瘤細(xì)胞已侵及干骺端骨膜組織，腫瘤的主體位于股骨肌肉組織內(nèi)，但已導(dǎo)致骨組織損傷。病理檢測的結(jié)果顯示，模型小鼠符合實驗要求。

3.2.2177Lu－DOTMP在荷瘤小鼠體內(nèi)生物分布

177Lu－DOTMP在昆明小鼠體內(nèi)的生物分布列于表1。表1 結(jié)果顯示，177Lu－DOTMP 在血中清除快，在注射1h后為（0.31±0.05）%ID／g，在3h至6d都保持在很低的水平；177Lu－DOTMP在骨中有明顯的放射性攝取，注射1h后已經(jīng)達(dá)到最高值，頭骨和股骨的放射性攝取分別為（18.00±4.68）和（16.67±5.11）%ID／g；注射48h 后，除骨骼外，血和其它主要臟器中都無明顯放射性富集；6d后骨中尚存較高放射性攝取。與正常小鼠體內(nèi)呈現(xiàn)出相似的代謝趨勢。177Lu－DOTMP在腎中比在其它臟器中攝取高，提示177Lu－DOTMP 主要通過腎臟排泄。荷瘤側(cè)的股骨放射性攝取略高于非瘤側(cè)股骨，可能與膦酸鹽在體內(nèi)的吸收途徑相關(guān)。177Lu－DOTMP在腫瘤組織中攝取很低，是由于在本研究中腫瘤組織不是靶向器官。DOTMP 能夠定位于骨，是傳遞足夠的放射性劑量進(jìn)行放射性治療，減輕骨轉(zhuǎn)移骨痛的基礎(chǔ)。

表1 177Lu－DOTMP在荷瘤小鼠體內(nèi)分布（±s，n＝5）

表1 177Lu－DOTMP在荷瘤小鼠體內(nèi)分布（±s，n＝5）

3.3 177Lu－DOTMP在健康兔體內(nèi)的顯像

注射177Lu－DOTMP 22h和46h后，正常日本大耳白兔的SPECT 顯像結(jié)果示于圖3。由圖3可以看出：注藥后22h，膀胱有明顯的放射性濃集，說明其主要經(jīng)泌尿系統(tǒng)排泄；在其他主要器官及軟組織中均未見明顯濃集，說明其在體內(nèi)的清除速度較快；在骨骼尤其是關(guān)節(jié)處的攝取高，可以看到全身骨骼輪廓，除膀胱外身體其它組織及器官中都已看不到放射性攝取，體現(xiàn)出177Lu－DOTMP作為骨痛治療藥物良好的體內(nèi)分布及藥代動力學(xué)性質(zhì)。

圖3 日本大耳白兔177Lu－DOTMP SPECT顯像

4 結(jié)論

1）本研究以1，4，7，10－四氮環(huán)十二烷為原料合成并純化得到產(chǎn)物DOTMP，產(chǎn)率約為63%。

在選定的實驗條件下，用177Lu標(biāo)記DOTMP形成的配合物177Lu－DOTMP，標(biāo)記率＞99.0%。

2）荷瘤鼠體內(nèi)生物分布結(jié)果顯示，177Lu－DOTMP可以選擇性地在骨組織吸收，具有良好的靶向性，而且在血中清除較快，在其他臟器只有少量攝取。

3）正常兔顯像結(jié)果顯示，177Lu－DOTMP 在骨中攝取高且滯留時間長。

以上結(jié)果提示，177Lu－DOTMP 作為潛在的骨轉(zhuǎn)移癌疼痛治療藥物，值得進(jìn)一步研究。

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