翁育偉，張長弓，王金章，林梅清，黃 萌，嚴延生

2.福建省人獸共患病研究重點實驗室，福州 350001；

3.福建醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，福州 350004；

4.廈門波生生物技術有限公司，廈門 361000

登革熱（dengue fever，DF）是一種由媒介傳播的病毒性傳染病。在過去的50年間，隨著登革熱在全球迅速擴散，登革熱的發(fā)病率上升了30倍。據(jù)估計，目前全球每年約有5千萬人感染登革病毒。在全球，登革熱流行區(qū)域已經(jīng)波及到熱帶、亞熱帶100多個國家和地區(qū)，對經(jīng)濟和社會造成巨大負擔是全球性的公共衛(wèi)生問題［1］。近年來，隨著對外經(jīng)貿(mào)、旅游的不斷發(fā)展，國內(nèi)報告輸入性登革熱病例也不斷增加，在東南沿海省份，還不時發(fā)生由輸入性病例導致的登革熱暴發(fā)流行［2－4］。鑒于登革熱的流行態(tài)勢及其潛在危害，我國已將登革熱列為重點防控的傳染病之一。

疫苗是預防和控制登革熱最有效的手段，但截至目前，全球尚無登革熱疫苗面市。因此，快速可靠的實驗室檢測在登革熱診斷、治療以及DF的預防控制中具有重要的作用。登革熱實驗室檢測方法主要包括登革病毒分離、病毒核酸檢測以及病毒抗體或抗體的血清學檢測等，但幾種方法各有局限性［1］。比如，病毒分離是實驗室檢測的金標準，但需要較長的檢測周期且檢測的敏感性不高，病毒核酸雖然具有敏感性、特異性高的優(yōu)點，但對設備和檢測人員的素質(zhì)要求較高。登革熱的實驗室檢測還受病程的影響，根據(jù)發(fā)病后不同的時期，需采用不同的檢測方法。相對于恢復期病例而言，急性期病例的診斷對登革熱治療、預防和控制更為重要。在幾種登革病毒診斷方法中，基于膠體金標記的免疫層析檢測法（immuno－chromatography test）因具有簡便、快速、無需復雜儀器設備、人員要求不高等特點，除適合于實驗室開展常規(guī)抗體檢測外，在暴發(fā)疫情的現(xiàn)場處置中更是具有不可比擬的優(yōu)勢。但截至目前，除國外主要試劑生產(chǎn)商有此類試劑面市外，國內(nèi)尚未見有類似試劑上市并應用于檢測工作中。在本研究中，我們利用在大腸桿菌中表達并具有免疫活性的1－4型登革病毒的外膜重組蛋白［5］，組裝膠體金免疫 層 析 試 紙 條 （immuno－chromatography strip，ICS），利用采集自備的血清盤，初步分析該試劑的檢測效果。

1 材料與方法

1.1 材料 登革病毒1－4型重組蛋白由本實驗室制備［5］。登革病毒IgM抗體膠體金試紙條由廈門波生生物技術有限公司組裝，其中血清型特異性膜條使用單一型別重組抗原組裝，通用膜條的使用4種重組抗原混合組裝。對照試劑采用IgM抗體捕獲法檢測試劑（Dengue IgM capture ELISA，澳大利亞Panbio公司），測試用陽性血清采集自登革病毒感染者，陰性血清采集自健康體檢者，瘧疾、鉤端等其它傳染病患者急性期血清為本室保存。病毒核酸抽提及RT－PCR試劑購置QIAGEN公司，Ex Taq酶、DNA marker等購自TaKaRa公司（大連）。

1.2 方法

1.2.1 血清樣品的采集和保存 使用無抗凝劑的真空采血管采集登革病毒感染者外周血，室溫放置1h后，1 000r/min離心10min，收集血清，置于－20℃保存?zhèn)溆?。其中登?型感染者血清采集自2004年福建省登革熱暴發(fā)［2］病例（除1例散發(fā)病例外）；登革2型感染者血清分采集自2007年福建省登革熱暴發(fā)［3］期間的病例；登革3型和4型病毒感染者血清采集自2004－2012年間福建省發(fā)現(xiàn)的輸入性散發(fā)病例，所有陽性血清均經(jīng)IgM抗體捕獲法ELISA證實。據(jù)流行病學調(diào)查資料，所有病毒感染者均為初次感染，無2次感染病例。對照血清采集自健康體檢者血清。測試用血清樣品情況見表1。

表1 本研究使用的血清樣品Tab.1 Composition of serum panel used in this study

1.2.2 病毒型別鑒定 取140μL急性期（發(fā)病至采樣時間≤7d）血清，按RNA mini kit（QIAGEN）說明書提取病毒核酸，按Lanciotti等［6］方法做反轉(zhuǎn)錄套式PCR，根據(jù)病毒核酸擴增結(jié)果判定病毒型別。部分病例血清為≥7d的恢復期血清，其型別根據(jù)配對的急性期血清的RT－PCR結(jié)果判定。

1.2.3 IgM 抗體捕 獲法 ELISA（IgM antibody capture ELISA，Mac ELISA）檢測 采用Panbio公司的Dengue IgM Capture ELISA試劑，按試劑說明書操作檢測血清樣品中的IgM抗體，其中，Index value＞1.1者判為陽性，≤1.1者判為陰性。

1.2.4 膠體金免疫層析法檢測 登革病毒IgM膠體金免疫層析試紙條由廈門波生生物技術有限公司組裝，按說明書操作。其中，對照線和檢測線同時顯色判為陽性，僅對照線顯色判為陰性，對照線不顯色則判為實驗無效。結(jié)果觀察在15min內(nèi)完成。

1.2.5 統(tǒng)計分析 兩種檢測方法結(jié)果的比較采用配對χ2檢驗，檢測方法一致性采用Kappa分析。

2 結(jié) 果

2.1 通用型ICS檢測結(jié)果 應用4種血清型混合抗原組裝的通用型ICS的檢測結(jié)果見表2。在Mac ELISA檢測陽性的69份標本中，ICS檢出陽性59份，Mac ELISA檢測陰性的111份標本中，ICS檢出陽性104份。以Mac－ELISA為參照，ICS的敏感性為85.5%（59/69），特異性為93.7%（104/111）。ICS與Mac ELISA兩種檢測方法的符合率為90.56%，兩種方法檢測結(jié)果的配對χ2檢驗表明，差異沒有統(tǒng)計學意義（P＝0.629），兩種檢測方法具有較高的一致性（Kappa＝0.799）。

2.2 分型ICS檢測結(jié)果 自血清盤中篩選 Mac ELISA法檢測陽性且RT－PCR結(jié)果陽性的血清標本28份，其中D1、D2型各10份，D3型7份，D4型1份。應用各型抗原單獨組裝的試紙條檢測IgM抗體，分型檢測結(jié)果表明，ICS型內(nèi)IgM的檢測陽性率為42.9%～100%，而非對應型別的抗體檢測陽性率為0%～33.3%。除D1型外，其它各型ICT均可檢出對非對應型別的IgM，表明分型ICS具有型間交叉反應。

2.3 通用ICS檢測其它病原體感染者血清 在180份血清中，有33份為其它方法確診的流行性出血熱（n＝13）、鉤端螺旋體（n＝8）、恙蟲?。╪＝8）、瘧疾（n＝4）患者血清標本，統(tǒng)計分析通用型ICS和Mac ELISA方法測試結(jié)果，結(jié)果表明，ICT通用型試紙條檢測的總體假陽性率（6/33）小于 Mac ELISA法（9/33），然而，ICT通用型試紙條對上述4種傳染病均存在交叉反應，而Mac ELISA檢測鉤體病時未出現(xiàn)交叉反應現(xiàn)象，見表4。

表2 免疫層析法和捕獲ELISA法檢測結(jié)果比較Tab.2 Comparison of ICS and Mac ELISA test

表3 免疫層析法分型檢測結(jié)果Tab.3 Sero－typing test results of ICS

表4 兩種方法的交叉反應檢測結(jié)果Tab.4 Cross－reactive antibody tested by two methods

3 討 論

登革病毒可分為1－4種血清型，任一種血清型病毒感染均可造成發(fā)熱、出疹、骨骼肌肉疼痛等典型的登革熱癥狀，嚴重者還可導致登革出血熱和登革休克綜合征；在感染早期，病毒在單核細胞內(nèi)迅速增殖并釋放到血液中，形成病毒血癥，在特異性免疫建立后，病毒才可得以逐步清除。因此病毒感染者在特異性抗體產(chǎn)生之前，將首先經(jīng)歷病毒血癥期，此時感染者血液中可以查到高滴度的病毒以及病毒非結(jié)構蛋白（nonstructural protein 1，NS1）；處于病毒血癥期的感染者可通過伊蚊等媒介的叮咬將病毒傳給健康人，這是病毒在人群中傳播和擴散的主要途徑。因此，在選擇和建立登革熱檢測方法和試劑時，應考慮到上述特點。良好的檢測試劑除了具備相當?shù)拿舾行院吞禺愋酝猓€應具備：可以檢測所有4種型別的登革病毒感染；可以在感染的急性期檢出病毒核酸、抗原、抗體或等特異性靶標；在實際應用中，應盡量便捷、快速。

本研究建立的登革病毒IgM抗體膠體金免疫層析試紙條檢測方法，除滿足上述要求外，還嘗試增加病毒血清學分型的功能，其原理是應用登革病毒外膜蛋白DIII區(qū)的型特異性表位來檢測型特異性抗體，從而達到分型的目的。血清學分型的目的是為了使實驗檢測結(jié)果更好地應用于疾病控制，比如病毒傳染源的追蹤、回顧性調(diào)查等工作中。從此次小樣本檢測的結(jié)果來看，通用型試紙條的檢測結(jié)果與Panbio公司的Mac ELISA方法的檢測結(jié)果的一致性程度較高（Kappa＝0.799）。Panbio公司的Mac ELISA是目前市面上使用最為廣泛的試劑之一，具有較高的敏感性和特異性［7］。因此，本研究制備登革病毒IgM抗體膠體金免疫層析試紙條具有進一步改進和應用的價值。從分型檢測的結(jié)果看，除了D1型試紙條可以清晰的判定對應的型別，其它型別的試紙條均不能很好地區(qū)分病毒的型別，其中的原因可能是我們所使用的重組抗原材料中，存在除型特異性表位外還包含有型交叉反應性表位［8］。有研究［7－9］表明，檢測登革病毒IgM 抗體時，可能與其它病原體抗體產(chǎn)生交叉反應，因此我們選取了部分流行性出血熱、恙蟲、鉤體病、瘧疾等病例血清用于測試ICS試劑的交叉反應情況，結(jié)果表明，與Mac ELISA比較，ICS法的交叉反應較低，但ICS可能與更多的病原體抗體產(chǎn)生假陽性反應。盡管這個結(jié)論需要更大樣本量的測試，但至少提示，在登革病毒抗體的檢測中，交叉反應問題應當引起重視。

目前，國外針對登革病毒早期診斷的試劑已經(jīng)得到較為完善的發(fā)展，除了病毒抗體的檢測試劑外，還發(fā)展了包括NS1抗原檢測在內(nèi)的多種檢測試劑［10－11］，而國內(nèi)登革熱的檢測試劑研發(fā)尚處于起步階段，缺乏具有競爭力的產(chǎn)品，特別是在快速檢測試劑方面，與國外尚有較大的差距，本研究目的是利用本實驗室表達的重組抗原，研制快速檢測試劑，用于替代進口產(chǎn)品，服務于我國的登革熱防控工作。本研究所制備的通用型檢測試紙條具有一定的潛力，后期我們將對其進行進一步的改進，并使用大樣本量的標本評價其應用效果。

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