葉 萍， 蔡軍偉， 付曉霞， 崔 航， 劉亞偉， 陳小歡，羅海華， 李煜生， 劉 蕓， 姜 勇， 劉靖華

(重大疾病的轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣東廣州510515)

SET是一高度保守的結(jié)構(gòu)域，因最初在果蠅的3個(gè)調(diào)節(jié)因子suppressor of variegation 3－9［Su(var)3－9］、enhancer of zeste［E(z)］和 trithorax的羧基末端發(fā)現(xiàn)而得名。含有SET結(jié)構(gòu)域的蛋白被稱為SET家族蛋白。SET家族蛋白廣泛分布于酵母和動(dòng)植物細(xì)胞中，目前經(jīng)過(guò)分離鑒定以及理論推測(cè)的SET家族蛋白有 300多種，其中人類有48種［1－2］。

2000年，Stephen首次發(fā)現(xiàn)含有SET結(jié)構(gòu)域的蛋白家族具有組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶的功能，即通過(guò)對(duì)組蛋白的甲基化修飾作用(主要作用于組蛋白H3/H4上的賴氨酸位點(diǎn))影響染色體結(jié)構(gòu)，調(diào)控基因表達(dá)［3－4］。近期研究發(fā)現(xiàn)，SET家族蛋白不僅具有組蛋白甲基化酶的作用，同時(shí)對(duì)非組蛋白也有甲基化酶的作用。如SET家族蛋白SET9、SMYD2可甲基化p53的不同賴氨酸位點(diǎn)，SETD6能甲基化核轉(zhuǎn)錄因子RelA(p65)310位賴氨酸，從而抑制炎癥因子白細(xì)胞介素6(interleukin－6，IL－6)、IL－1和 IL－8等釋放［5－10］。越來(lái)越多的研究表明SET家族蛋白通過(guò)上述甲基化酶作用參與了炎癥及腫瘤的發(fā)生發(fā)展［11－12］。因此，探討SET家族蛋白的功能對(duì)于闡明各種炎癥相關(guān)性疾病及腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制具有重要的理論價(jià)值。

SETD4(SET domain containing 4)屬于SET家族蛋白中的一種，但是目前對(duì)其鮮見(jiàn)報(bào)道。為了探討SETD4的生物學(xué)功能，本研究首先對(duì)SETD4在不同細(xì)胞中的表達(dá)和分布特點(diǎn)進(jìn)行了觀察，接下來(lái)觀察了亞砷酸鈉(sodium arsenite，NaAsO2)刺激對(duì) SETD4蛋白表達(dá)水平和定位的影響，并初步研究上述改變是否與p38 MAPK信號(hào)通路有關(guān)。

材料和方法

1 材料

CO2培養(yǎng)箱(Heraeus)，細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco－BRL)，胎牛血清(HyClone)，SETD4多克隆抗體(Santa Cruz，編號(hào) sc－133993，可檢測(cè)人或鼠SETD4)，β－actin抗體(Bioworld Technology)，anti－rabbit抗體(Cell Signaling Technology)，ReverTra Ace qPCR RT kit(Toyobo)，Alexa Fluor 594偶聯(lián)的抗兔IgG(Molecular Probes)，細(xì)胞裂解液(CST)，引物合成由深圳華大基因公司完成。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(wild－type mouse embryonic fibroblasts， MEFs， C57B1/6 background)p38+/+和p38－/－細(xì)胞系由美國(guó)Scripps研究所韓家淮博士饋贈(zèng)。p38+/+細(xì)胞表達(dá)正常的 p38蛋白，p38－/－細(xì)胞則不表達(dá) p38 蛋白［13］。

2 方法

2．1 細(xì)胞培養(yǎng) NIH 3T3(小鼠成纖維細(xì)胞)、293T(人胚胎腎細(xì)胞)、Raw 264．7(小鼠巨噬細(xì)胞)、QSG(人正常肝臟細(xì)胞)、HepG2(人肝臟腫瘤細(xì)胞)、SMMC(人源肝癌細(xì)胞)、U2－OS(小鼠骨肉瘤細(xì)胞)(以上細(xì)胞由本室保存)、p38+/+和 p38－/－細(xì)胞均用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基在CO2培養(yǎng)箱(5%CO2，37 ℃)中培養(yǎng)。

2．2 NaAsO2刺激細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞接種在6 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)，無(wú)血清培養(yǎng)6 h，再給予100 μmol/L NaAsO2刺激，分別在刺激后 0、0．5、1、2、3和6 h收集細(xì)胞，按下述方法提取細(xì)胞總蛋白。

2．3 Western blotting檢測(cè)SETD4蛋白的表達(dá) 將收集的細(xì)胞用細(xì)胞裂解緩沖液(20 mmol/L Tris－HCl pH7．5，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L Na2EDTA，1 mmol/L EGTA，10%Triton，2．5 mmol/L 焦磷酸鈉，1 mmol/Lβ－磷酸甘油，1 mmol/L釩酸鈉)裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白?？偟鞍子肂radford法蛋白定量，取等量的總蛋白行12%SDS－PAGE蛋白凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。經(jīng)5%脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉2 h后，再與1∶1 000稀釋的I抗4℃孵育過(guò)夜，然后與1∶1 000稀釋的HRP(辣根過(guò)氧化物酶)偶聯(lián)的抗兔IgG室溫孵育1 h，采用Pierce公司的SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色，利用Kodak IS4000R圖像工作站［Carestream公司(原Kodak)］進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

2．4 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn) 接種1×105細(xì)胞至Petri皿中，6 h后補(bǔ)液，生長(zhǎng)12～18 h，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)換用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)6 h，NaAsO2刺激組給予100μmol/L NaAsO2刺激1 h。棄去細(xì)胞上清，PBS洗滌細(xì)胞3次，以4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，PBS 洗3 次，5 min/次，然后用含 0．1%Triton X－100的 PBS(PBST)透化細(xì)胞膜5 min，PBS洗3次，5 min/次，用質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0．1%硼氫化鈉(NaBH4)孵育細(xì)胞5 min，PBST洗3次，5 min/次，用3%BSA封閉1 h，PBST洗3次后用抗－SETD4特異性抗體(1∶500稀釋)4°孵育過(guò)夜，次日取出室溫孵育1 h，PBST洗3次后，用 Alexa Flour－594偶聯(lián)的抗兔IgG(1∶1 000稀釋)室溫孵育1 h，DAPI染核10 min，PBS洗3次，5 min/次，然后PBS封片，于Zessi熒光顯微鏡下觀察和圖像采集。

3 SETD4的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

小鼠SETD4(accession number:P58467)和人的SETD4(accession number:NP_059134)一級(jí)結(jié)構(gòu)信息來(lái)源于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(the National Center for Biotechnology Information，NCBI);小鼠SETD4蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)采用 PSIPRED 3．0預(yù)測(cè)(http://bioinf．cs．ucl．a(chǎn)c．uk/psipred/)。

結(jié) 果

1 SETD4的結(jié)構(gòu)特征

小鼠SETD4由439個(gè)氨基酸組成，人SETD4是440個(gè)氨基酸，兩者序列的一致性為77%(338/440)，保守性為87%(382/440)。SETD4主要由2個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，位于羧基末端的SET結(jié)構(gòu)域(小鼠:第33～278位氨基酸;人:第34～279位氨基酸)和位于氨基端末端的底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(小鼠:第306～424位氨基酸;人:第307～425位氨基酸)，見(jiàn)圖1A。小鼠SETD4的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖有16個(gè)α螺旋(α－h(huán)elix，粉紅色)、8個(gè) β折疊結(jié)構(gòu)(β －strand，黃色)以及不規(guī)則卷曲組成，見(jiàn)圖1B。

Figure 1．Characterization of SETD4．A:the domains of mouse SETD4(mSETD4)and human SETD4(hSETD4);B:the secondary structure of mouse SETD4．Subs－binding:substrate－binding domain．圖1 SETD4的結(jié)構(gòu)特征

2 SETD4在不同細(xì)胞中的表達(dá)

SETD4蛋白在鼠源(Raw 264．7、U2 － OS、NIH 3T3和MEFs)和人源(293T、QSG、HepG2和 SMMC)的細(xì)胞中均有表達(dá)，在總蛋白量相同的情況下鼠源細(xì)胞的表達(dá)水平較人源的高，并且鼠源細(xì)胞在40 kD附近有2條帶，而人源的只有分子量較大的1條帶，見(jiàn)圖2。這提示盡管SETD4在不同種屬、不同組織來(lái)源的細(xì)胞均有表達(dá)，但是其表達(dá)特征有一定區(qū)別。

3 SETD4在細(xì)胞中的定位

細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示SETD4在整個(gè)細(xì)胞中分布，以胞質(zhì)較多，見(jiàn)圖3。

4 p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)NaAsO 2誘導(dǎo)的細(xì)胞SETD4蛋白表達(dá)的影響

Figure 2．Expression of SETD4 in different cells．圖2 SETD4蛋白在不同細(xì)胞中的表達(dá)

p38+/+細(xì)胞受NaAsO2刺激后其SETD4蛋白的表達(dá)在0．5 h、1 h、2 h、3 h 沒(méi)有明顯變化，但在6 h 時(shí)明顯下降;p38－/－細(xì)胞受 NaAsO2刺激后其 SETD4蛋白的表達(dá)趨勢(shì)與p38+/+一致，即均在6 h時(shí)有明顯減少，提示p38信號(hào)通路可能沒(méi)有參與NaAsO2誘導(dǎo)的SETD4表達(dá)的改變，見(jiàn)圖4。

Figure 3．The location of SETD4 in Raw 264．7 cells and MEFs(immunofluorescent staining，×600)．圖3 SETD4在NIH 3T3、Raw264．7細(xì)胞中的定位

Figure 4．Expression of SETD4 protein in p38+/+and p38 －/－cells following NaAsO2 treatment．圖4 NaAsO2刺激對(duì)p38+/+和p38－/－細(xì)胞 SETD4蛋白表達(dá)的影響

5 NaAsO2誘導(dǎo)的SETD4蛋白移位入核依賴于p38信號(hào)通路

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，靜息狀態(tài)下 SETD4在 p38+/+、p38－/－細(xì)胞的胞漿和胞核中均有分布，但主要分布于胞漿中;100μmol/L NaAsO2刺激1 h后，p38+/+細(xì)胞核內(nèi) SETD4明顯增多，但是 p38－/－細(xì)胞中SETD4的分布沒(méi)有明顯改變，提示NaAsO2能誘導(dǎo)SETD4蛋白移位入核，并且依賴于p38信號(hào)通路。另外，NaAsO2刺激后p38+/+和p38－/－細(xì)胞中SETD4蛋白在胞漿呈現(xiàn)點(diǎn)狀聚集，見(jiàn)圖5。

討 論

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)SETD4蛋白表達(dá)水平(含量)與種屬有關(guān)，即在總蛋白量相同的情況下鼠源細(xì)胞SETD4蛋白表達(dá)水平(含量)較人源的高，而與細(xì)胞是否是腫瘤細(xì)胞關(guān)系不大，提示SETD4參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能主要是通過(guò)改變活性形式而不是上調(diào)表達(dá)水平。SETD4的理論分子量是49 kD，但是我們?cè)?0 kD附近檢測(cè)到鼠源細(xì)胞有2條帶，而人源的只有分子量較大的1條帶，提示SETD4的遷移率發(fā)生了改變，這可能與其剪切形式發(fā)生了改變或者發(fā)生了翻譯后修飾有關(guān)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SETD4可能有多種不同的剪切形式，本實(shí)驗(yàn)觀察到的結(jié)果屬于哪種情況還有待實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步證實(shí)。

Figure 5．Localization and translocation of SETD4 in p38+/+and p38 －/－ cells following NaAsO2 treatment(immunofluorescent staining，×600) ．圖5 NaAsO2對(duì)p38+/+和p38－/－細(xì)胞SETD4蛋白的定位及移位的影響

p38是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)家族中的一個(gè)重要成員，參與多種生理和病理過(guò)程的調(diào)節(jié)［14］。在不同刺激條件下，p38 MAPK可通過(guò)不同方式活化來(lái)介導(dǎo)不同細(xì)胞的生物學(xué)功能。例如，p38可分別通過(guò)磷酸化轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白及酶等多種底物來(lái)調(diào)節(jié)應(yīng)激、凋亡、炎癥和細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等過(guò)程，而且還參與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化(malignant transformation)和腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移(tumor invasion and metastasis)等病理過(guò)程的調(diào)控［15］。由于SET家族蛋白與炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展有很大關(guān)系，因此，本研究用p38+/+和p38－/－細(xì)胞首先探討了p38 MAPK對(duì)亞砷酸鹽刺激后細(xì)胞SETD4表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論是否有p38的存在，當(dāng)細(xì)胞受到NaAsO2刺激后SETD4蛋白表達(dá)趨勢(shì)一致，提示p38 MAPK對(duì)SETD4的表達(dá)可能不發(fā)揮主要的調(diào)控作用。接下來(lái)，我們研究了p38 MAPK對(duì)亞砷酸鹽刺激后細(xì)胞SETD4定位及其移位的影響。結(jié)果表明，如果p38缺失，細(xì)胞被激活后SETD4蛋白就不能從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核移位，提示SETD4的移位有賴于p38 MAPK通路。信號(hào)蛋白的亞細(xì)胞定位和激活后移位已成為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中的重要內(nèi)容。目前認(rèn)為，信號(hào)蛋白的定位和激活后移位以及伴隨的與其它蛋白的可逆性結(jié)合是信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行有效傳遞的關(guān)鍵所在。在很多情況下，信號(hào)蛋白需要錨定于適配體蛋白、細(xì)胞骨架及細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，或與其上游激酶和下游底物結(jié)合來(lái)發(fā)揮正常功能。信號(hào)分子的特異性定位有助于細(xì)胞高效地完成各種正常功能和病理反應(yīng)。因此，進(jìn)一步明確p38 MAPK如何影響SETD4的移位及SETD4結(jié)合蛋白對(duì)闡明SETD4的功能，進(jìn)而探索其在炎癥和腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演的角色有非常重要的意義。

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