ITP患者脾切除前后外周血Th亞群細(xì)胞因子的變化及意義*

王 俊， 鄭 冬， 張瓏涓， 鄭朝旭△

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院1微創(chuàng)外科，2血液內(nèi)科，3外科實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510080)

原發(fā)性免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)，原稱特發(fā)性血小板減少性紫癜，是以抗血小板自身抗體介導(dǎo)的自身血小板在脾臟、肝臟、骨髓等單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)中破壞增多為特征的一種自身免疫性出血性疾病。ITP的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，近年來不少研究表明除體液免疫機(jī)制外，細(xì)胞免疫機(jī)制不容忽視，其中活化的CD4+T淋巴細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子的平衡紊亂發(fā)揮著重要作用［1］。目前ITP患者的治療首選糖皮質(zhì)激素，但60%～70%患者激素治療療效欠佳。

脾臟是抗血小板自身抗體產(chǎn)生和血小板破壞的主要場所，脾切除術(shù)可以減少血小板自身抗體的產(chǎn)生以及血小板破壞，能迅速提升血小板，緩解病情，是治療激素依賴型和激素?zé)o效型ITP的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但目前脾切除術(shù)治療ITP患者的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)的改變還不是很清楚。CD4+T淋巴細(xì)胞即輔助性T淋巴細(xì)胞(T helper lymphocyte，Th)，是人體免疫防御機(jī)制的核心環(huán)節(jié)，可通過分泌多種細(xì)胞因子進(jìn)行免疫調(diào)控作用。國內(nèi)外文獻(xiàn)關(guān)于ITP患者脾切除治療前后的Th亞群細(xì)胞因子的改變僅見個案報道［2］。本研究采用基于Luminex液相芯片技術(shù)的Quanti-Gene Plex(QGP)方法，檢測脾切除術(shù)前后ITP患者和健康志愿者外周血Th1［白細(xì)胞介素－2(interleukin－2，IL－2)和干擾素 γ(interferon γ，TFN －γ)］、Th2(IL－4、IL－5、IL－6和 IL－10)、Th3［轉(zhuǎn)化生長因子 β1(transforming growth factorβ1，TGF－β1)］和Th17(IL－17)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的差異，探討Th亞群細(xì)胞因子在ITP發(fā)病中的作用及脾切除術(shù)對Th亞群細(xì)胞因子功能狀態(tài)的影響。

材料和方法

1 材料

1．1 研究對象 選擇2009年4月～2011年6月入住中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院微創(chuàng)外科成功完成腹腔鏡脾切除術(shù)的ITP患者22例，男8例，女14例，中位年齡34(10～63)歲。所有ITP患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照英國血液學(xué)學(xué)會發(fā)表的關(guān)于ITP的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，所有患者初診時血小板計(jì)數(shù)均＜100×109/L，經(jīng)骨髓穿刺檢查骨髓像符合ITP表現(xiàn)，并排除其它繼發(fā)性血小板減少性疾病。術(shù)前所有患者均經(jīng)過正規(guī)足量激素治療。ITP患者脾切除術(shù)適應(yīng)證為激素?zé)o效型和激素依賴型患者。健康體檢者30例作為對照組，男18例，女12例，中位年齡43(25～82)歲。實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會審批通過，標(biāo)本收集前均簽署本人知情同意書。

1．2 主要儀器和試劑 Luminex 200檢測平臺(Luminex)、渦旋混合器(科學(xué)儀器股份有限公司)、Labnet溫浴搖床(LabNet)、微孔板離心機(jī)(Eppendorf 5804R，Eppendoff)、微量離心機(jī)(Eppendorf 5415D，Eppendoff)、磁力架(Affymetrix);QuantiGene Plex 2．0試劑盒(Affymetrix);目的基因(IL－2、IFN －γ、IL－4、IL－5、IL－6、IL－10、TGF－β1和 IL－17)和管家基因(PPIB和β－actin)的探針均由Affymetrix公司設(shè)計(jì)并合成。

2 方法

2．1 標(biāo)本采集 在ITP患者脾切除術(shù)前3 d及術(shù)后7 d，清晨空腹抽取外周靜脈血2 mL，放入含有枸櫞酸鈉抗凝劑的試管中，收集靜置后直接放入－80℃冰箱中凍存?zhèn)溆?，集中檢測。對照組采血及保存方法同ITP患者。

2．2 QGP檢測目的基因mRNA表達(dá) 應(yīng)用QGP方法同時檢測外周血8個細(xì)胞因子(IL－2、IFN－γ、IL－4、IL－5、IL －6、IL －10、TGF－β1和 IL －17)mRNA表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行。使用QuantiGene plex 2．0樣本處理試劑盒中的裂解液將全血樣本裂解，使總RNA釋放出來。然后將裂解后的樣品分別加入96孔板的每個孔中，每孔加80 μL，并在每個孔中加入20μL稀釋的探針磁珠試劑，然后將96孔板放入Labnet溫浴搖床中54℃過夜雜交(18 h)。將雜交過夜后的混合物轉(zhuǎn)移至固定于磁力架上的磁性分離板，用緩沖液洗滌3次，按步驟依次加入按比例稀釋的Pre－Amplifier、Amplifier、Label probe，每一步完成后放入恒溫?fù)u床雜交1 h，溫度控制在(50．0±0．5)℃，緩沖液洗滌3次，信號逐層放大。最后加入熒光底物，常溫染色30 min，最后通過Luminex 200檢測平臺檢測相對信號強(qiáng)度。以βactin為內(nèi)參照，目的基因的檢測值與β－actin的檢測值相比之后得到的相對定量信號值作為該目的基因mRNA的相對表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13．0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件包(SPSS Inc)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示。一般資料中年齡比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，性別比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。術(shù)前和術(shù)后的數(shù)據(jù)的比較應(yīng)用配對資料的符號秩檢驗(yàn)(Wilcoxon signed rank test)，術(shù)前和對照組、術(shù)后和對照組的數(shù)據(jù)比較應(yīng)用兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)(Wilcoxon rank sum test)。細(xì)胞因子之間的相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)方法。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 一般資料比較

如表1所示，ITP患者與健康對照組之間的年齡及性別比構(gòu)成差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。

2 外周血Th1、Th2、Th3和Th17細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平變化

2．1 Th1細(xì)胞因子 術(shù)前組外周血IL－2 mRNA水平顯著低于對照組(P＜0．05);術(shù)后組IL－2 mRNA水平明顯高于術(shù)前組(P＜0．05)，但仍低于正常對照組(P＜0．05)，見圖1A。對照組、術(shù)前組和術(shù)后組外周血IFN－γmRNA水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，見圖1B。

表1 ITP組和健康對照組之間的一般資料比較Table 1．Comparison of clinical data in ITPpatients and controls

Figure 1．The mRNA expression changes of Th cytokines in ITPpatients before splenectomy(Pre－op)and after splenectomy(Postop)．A:IL－2;B:IFN－γ;C:TGF－β1;D:IL－17．ˉx±s．control:n=30;Pre－op:n=22;Post－op:n=22．*P＜0．05 vs control;△P ＜0．05 vs Pre－op．圖1 ITP患者脾切除術(shù)前后Th細(xì)胞因子mRNA相對表達(dá)水平的變化

2．2 Th2細(xì)胞因子 對照組、術(shù)前組和術(shù)后組外周血Th2細(xì)胞因子(IL－4、IL－5、IL－6和 IL－10)mRNA表達(dá)水平均非常低，基本低于試劑盒的檢測范圍下限。

2．3 Th3細(xì)胞因子 術(shù)前組和對照組之間TGF－β1mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05);術(shù)后組TGF－β1mRNA水平顯著高于術(shù)前組及對照組(P＜0．05)，見圖1C。

2．4 Th17細(xì)胞因子 術(shù)前組IL－17 mRNA水平顯著高于對照組(P＜0．05);術(shù)后組IL－17 mRNA水平與術(shù)前組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，但術(shù)后組的IL－17 mRNA水平仍明顯高于對照組(P ＜0．05)，見圖1D。

3 ITP患者細(xì)胞因子之間的相關(guān)性

對術(shù)前和術(shù)后4種細(xì)胞因子(IL－2、IFN－γ、TGF－β、IL－17)mRNA相對表達(dá)量之間進(jìn)行相關(guān)性分析。如表3所示，ITP患者術(shù)前IL－2與IFN－γ之間呈正相關(guān)(r=0．647，P ＜0．01)，其它細(xì)胞因子之間均無明顯相關(guān)性(P＞0．05)。

表3 術(shù)前ITP患者的細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平之間的相關(guān)性分析Table 3．Correlations between cytokine mRNA expression in ITP preoperative patients

ITP患者術(shù)后3對細(xì)胞因子之間呈正相關(guān)，分別是 IL－2與IFN －γ(r=0．787，P ＜0．01)，IL－2與IL－17(r=0．554，P ＜0．01)，IFN －γ 與 IL －17(r=0．461，P ＜0．05);其它細(xì)胞因子之間均無明顯相關(guān)性(P ＞0．05)，見表4。

表4 術(shù)后ITP患者的細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平之間的相關(guān)性分析Table 4．Correlations between cytokine mRNA expression in ITP postoperative patients

討 論

ITP是一種自身免疫性的器官特異性血液病，主要是由于抗血小板自身抗體介導(dǎo)的血小板破壞或者血小板生成受損所導(dǎo)致。自身反應(yīng)性B淋巴細(xì)胞分泌自身抗體被認(rèn)為是經(jīng)典的ITP發(fā)病機(jī)制，但是B細(xì)胞產(chǎn)生抗體需要特異性自身反應(yīng)性T細(xì)胞的輔助。因此，活化的CD4+Th細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子失衡在ITP發(fā)病中的作用越來越受到重視。本團(tuán)隊(duì)前期研究初步發(fā)現(xiàn)了ITP患者的外周血T細(xì)胞亞群(主要是CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞)存在異常以及脾臟細(xì)胞免疫存在異常［4－5］。為進(jìn)一步深入研究ITP患者CD4+T淋巴細(xì)胞(Th)分泌的細(xì)胞因子的功能狀態(tài)及脾切除術(shù)對細(xì)胞因子的影響，我們檢測了脾切除術(shù)前后外周血CD4+T淋巴細(xì)胞分泌的8種主要細(xì)胞因子mRNA表達(dá)情況。

CD4+Th淋巴細(xì)胞根據(jù)分泌細(xì)胞因子種類的不同，通?？梢苑譃?個細(xì)胞亞群:Th1、Th2和Th3亞群。Th1細(xì)胞主要是產(chǎn)生IL－2和IFN－γ等細(xì)胞因子，參與巨噬細(xì)胞活化過程，介導(dǎo)細(xì)胞免疫;而Th2細(xì)胞主要是產(chǎn)生IL－4、IL－5、IL－6和IL－10等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)抗體生成，介導(dǎo)體液免疫。Th3細(xì)胞主要通過分泌免疫調(diào)節(jié)因子TGF－β1，下調(diào)抗原提呈細(xì)胞，其功能與免疫耐受誘導(dǎo)密切相關(guān)。最近發(fā)現(xiàn)的一種新的效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞亞群，以分泌IL－17為特征，因此被命名為Th17細(xì)胞，已發(fā)現(xiàn)其在防御胞外菌感染、介導(dǎo)慢性炎癥、自身免疫性疾病和腫瘤發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

正常情況下，Th1和Th2細(xì)胞亞群的平衡對調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)是非常必要的，多種自身免疫性疾病均存在Th1/Th2細(xì)胞亞群比例的失衡。多數(shù)研究表明ITP主要表現(xiàn)為Th1細(xì)胞占優(yōu)勢和Th1細(xì)胞因子活化模式［6－7］，也有研究者持中立態(tài)度［8］或反對這種觀點(diǎn)［9］。而在本研究中，術(shù)前ITP患者IL－2 mRNA表達(dá)水平較對照組下降，提示ITP的發(fā)病可能與Th1細(xì)胞因子被抑制有關(guān)。經(jīng)過脾切除后，IL－2 mRNA水平有所升高，但仍低于正常對照組，說明經(jīng)過手術(shù)治療，機(jī)體的免疫功能有所恢復(fù)，但I(xiàn)L－2尚未完全恢復(fù)至正常水平。Andersson等［8］應(yīng)用 ELISA方法檢測ITP患者和健康對照組的血清細(xì)胞因子水平，發(fā)現(xiàn)兩組IL－2、IFN－γ和IL－4表達(dá)水平均無法檢測出，低于試劑盒的檢測下限，這與本研究的部分結(jié)果有一定相似性。

Th3細(xì)胞因子TGF－β1被認(rèn)為是B細(xì)胞增殖和抗體分泌的一個重要的抑制因子，且TGF－β1還可抑制T細(xì)胞增殖及阻止Th1和Th2細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病的發(fā)生。Gorelik等［10］發(fā)現(xiàn)TGF－β1是維持自身免疫系統(tǒng)穩(wěn)定的一個關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)者，TGF－β1的減少導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)的激活。Andersson等［8］發(fā)現(xiàn)慢性ITP緩解期患者相對于活動期患者和健康對照組TGF－β1的表達(dá)水平更高，認(rèn)為TGF－β1在疾病緩解期介導(dǎo)的旁路免疫抑制效應(yīng)可能發(fā)揮重要作用。他們隨后的研究又發(fā)現(xiàn)ITP患者活動期外周血單個核細(xì)胞(PBMC)生成TGF－β1減少［11］。Fahim等［12］報道，急性和慢性ITP患者TGF－β1mRNA表達(dá)水平均明顯低于正常對照組，慢性ITP活動期患者的TGF－β1mRNA水平顯著低于緩解期患者。這些研究結(jié)果提示，慢性ITP活動期可能與Th3反應(yīng)的下調(diào)有關(guān)，而病情緩解可能是由于Th3反應(yīng)上調(diào)所引起。本研究對象均為經(jīng)過正規(guī)足量激素治療的慢性患者，術(shù)前病情已經(jīng)得到部分緩解。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)前組TGF－β1mRNA表達(dá)水平與正常對照組無顯著差異，與上述研究結(jié)果基本吻合。術(shù)后患者TGF－β1mRNA水平較術(shù)前組及對照組均明顯升高，提示脾切除術(shù)可上調(diào)TGF－β1基因表達(dá)水平，發(fā)揮旁路免疫抑制效應(yīng)，激活Th3反應(yīng)，從而進(jìn)一步使患者病情得到緩解。

研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞可介導(dǎo)多種自身免疫性疾病，包括實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎、膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病等，而這些疾病過去都被認(rèn)為主要是由Th1細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子所介導(dǎo)。此外，有越來越多的研究將焦點(diǎn)放在明確Th17細(xì)胞在器官特異性疾病的發(fā)病機(jī)制中所起的作用;已有研究證明Th17細(xì)胞比Th1細(xì)胞在誘導(dǎo)自身免疫性疾病方面更有效也更有影響力。細(xì)胞因子IL－17也被發(fā)現(xiàn)在人類多種自身免疫性疾病中是增高的，包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥和銀屑病等。而IL－17與ITP的相關(guān)研究較少，且得出的結(jié)論存在不統(tǒng)一。Guo等［13］和 Ma等［14］研究認(rèn)為 ITP 的發(fā)病與 IL －17無明顯關(guān)系;而 Wang 等［15］和 Rocha 等［16］研究發(fā)現(xiàn)ITP患者血清IL－17蛋白水平升高。本研究結(jié)果顯示，ITP患者術(shù)前和術(shù)后的IL－17 mRNA表達(dá)水平均較對照組升高，但術(shù)前和術(shù)后無顯著差異，提示IL－17在ITP發(fā)病中可能具有非常重要的作用，但脾切除治療短時間內(nèi)并不能下調(diào)IL－17 mRNA表達(dá)水平。

本研究對ITP患者術(shù)前和術(shù)后4種細(xì)胞因子(IL－2、IFN－γ、TGF－β和IL－17)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)術(shù)前和術(shù)后IL－2和IFN－γ均成正相關(guān)，可能是由于Th1細(xì)胞因子之間存在協(xié)同作用。術(shù)后ITP患者的IL－17與IFN－γ、IL－2之間均成正相關(guān)，提示ITP患者的Th1和Th17細(xì)胞因子之間可能也存在相互影響的作用。

目前多采用RT－PCR傳統(tǒng)方法檢測基因mRNA表達(dá)水平，但由于步驟繁瑣、易受干擾等因素等影響了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。mRNA表達(dá)的準(zhǔn)確性和敏感性對于基因研究尤為重要，所以本研究選擇采用基于b－DNA技術(shù)和Luminex液相芯片技術(shù)的QuantiGene Plex(QGP)方法。其優(yōu)勢是直接從全血樣本中檢測目的基因表達(dá)，而且可在同一反應(yīng)孔中同時對多個基因進(jìn)行精確定量。它無需抽提純化、無需逆轉(zhuǎn)錄、無需PCR擴(kuò)增，只需要簡單的細(xì)胞溶解過程，經(jīng)探針雜交與信號放大即可快速得到比RTPCR更加精確的定量結(jié)果，因而避免了很多人為因素對實(shí)驗(yàn)的干擾。實(shí)踐證明，QGP技術(shù)在精確度、準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性等方面均優(yōu)于RT－PCR，并且與RTPCR有良好的相關(guān)性［17］。提示QGP技術(shù)可以作為檢測基因表達(dá)水平的高通量、多樣本的手段，可應(yīng)用于臨床和實(shí)驗(yàn)研究。目前國內(nèi)外尚未見到將QGP技術(shù)應(yīng)用于ITP研究中的報道。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，手術(shù)前ITP患者IL－2表達(dá)較正常對照明顯降低，IL－17表達(dá)較正常對照明顯上升，而IFN－γ和TGF－β1較正常對照無明顯差別。脾切除術(shù)治療后，TGF－β1表達(dá)較治療前明顯升高;IL－2表達(dá)較治療前有所升高，但仍低于正常對照;而IFN－γ和IL－17較治療前無明顯差別。本研究表明，ITP患者存在Th亞群細(xì)胞因子表達(dá)失衡，脾切除術(shù)治療作為激素依賴或無效的ITP患者的有效手段，可改善ITP患者部分Th亞群細(xì)胞因子的失衡。

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